F-aktyna

Crystal Structure of F-actin, 2zwh

Jednostki aktyny filamentowej (F-aktyna) są również określane jako mikrofilamenty i są wysoce konserwowanymi, białkowymi składnikami występującymi prawie wszechobecnie w cytoszkieletach eukariotycznych. F-aktyna i inne białka aktyny ogólnie mają role strukturalne w komórkach.

Wprowadzenie

Aktyna występuje w prawie wszystkich komórkach eukariotycznych i jest znana przede wszystkim z funkcji jako białko strukturalne i translokacyjne. Pełni również funkcję ATPazy, ponieważ hydrolizuje ATP do ADP i Pi oraz ulega zmianom konformacyjnym przy każdej hydrolizie. Ze względu na zależne od nukleotydów zmiany konformacyjne, aktyna należy do nadrodziny aktynowej, do której należą inne białka, takie jak Hsp70(DnaK), Hsc70 i heksokinaza. Ze względu na podobieństwo zaobserwowane u Escherichia Coli, Hsc70 i domeny ATPazy aktyny, uważa się, że te dwa białka mają wspólnego przodka. Nie wiadomo, czy prokariota posiada aktyny, ale posiada homolog aktyny, MreB, co również prowadzi do przypuszczeń o możliwym wspólnym pochodzeniu.

Aktyna występuje w dwóch formach: aktyna globularna (G-aktyna), wolne monomeryczne jednostki aktyny, i aktyna nitkowata (F-aktyna), która jest formą polimeru. Te dwie formy pozostają ze sobą w dynamicznej równowadze, ponieważ w komórce nieustannie zachodzi polimeryzacja i depolimeryzacja związana z ATP. Jednostki monomeru w F-aktynie posiadają formę, która różni się od wolnej formy monomerycznej i to właśnie w wyniku tej zmiany można zaobserwować bardziej specyficzną aktywność ATPazy.

Montaż

(1J6Z).

G-aktyna jest wolną formą monomeryczną aktyny, która polimeryzuje do F-aktyny. Struktury aktyny globularnej i filamentowej różnią się od siebie pod wieloma względami, pomimo faktu, że G-aktyna składa się z F-aktyny. Kiedy monomeryczna aktyna ulega polimeryzacji do F-aktyny, jej jednostka staje się spłaszczona. Ponadto F-aktyna posiada funkcję ATPazy, która w G-aktynie jest minimalna. Domeny i miejsce aktywne są takie same pod względem elementów składowych i zostaną omówione później w odniesieniu do monomeru F-aktyny.

G-aktyna wydaje się mieć więcej ligandów w swojej strukturze, zewnętrznych w stosunku do miejsca aktywnego. Uważa się, że tylko 3 z 5 rzeczywiście istnieją w roztworze i przyczyniają się do polimeryzacji G-aktyny do F-aktyny. Ta reprezentacja G-aktyny posiada również cząsteczkę, która jest obserwowana w niektórych strukturach krystalicznych aktyny, ale niekoniecznie. Obserwowana cząsteczka na Cys374, została użyta do zablokowania aktywności polimeryzacji, dzięki czemu można było zaobserwować kryształ G-aktyny

Formowanie F-aktyny jest dynamicznym procesem montażu i demontażu, który został określony mianem „treadmilling”. Przejście między G i F-aktyną rozpoczyna się od ustabilizowanego oligomeru jednostek ATP-aktyny utworzonego poprzez wzór składania typu nukleacja-kondensacja. Następnie następuje dodanie jednostek ATP-monomerycznych do każdego z końców, jednak z powodu różnicy w polaryzacji ładunków na obu końcach, następuje preferencyjne dodanie do tego, co określa się jako „koniec plusowy (+)” lub „koniec kolczasty”. Na przeciwnym końcu, „minus (-) koniec” lub „spiczasty koniec”, jest preferencyjna dysocjacja jednostek aktyny.

Po przyłączeniu aktyny związanej z ATP, następuje hydroliza ATP dając stan związany z ADP i Pi. Późniejsza utrata Pi pozostawia stan ADP-aktyny. Ze względu na możliwość dodawania lub usuwania jednostek monomerycznych na obu końcach, montaż F-aktyny może być opisany w kategoriach równowagi. Jednakże, ponieważ szybkość asocjacji ATP-aktyny jest dziesięciokrotnie większa niż dysocjacji ADP-aktyny, F-aktyna sprawia wrażenie poruszającej się do przodu lub „drepczącej”. Monomery ADP-aktyny dysocjują na końcu minusowym i zostają ponownie włączone do ATP-aktyny, dzięki czemu polimeryzacja na końcu plusowym może nastąpić ponownie.

Struktura

Historia struktury

Białko F-aktyny zostało odkryte przez Strauba w 1942 roku. Struktura była spekulowana w oparciu o niskorozdzielczy krystalograf rentgenowski znaleziony w 1990 roku przez Holmesa i wsp. i w tym czasie przyjęto „model Holmesa”. W przeciwieństwie do tego, struktura G-aktyny została określona niezależnie ponad 30 razy. Model F-aktyny o wyższej rozdzielczości został dopiero niedawno zdeponowany w banku danych PDB w grudniu 2008 roku przez Oda i wsp. .

Monomer i polimer F-aktyny

(2zwh)

Monomer

Każda monomeryczna jednostka F-aktyny posiada, jako część swojej struktury trzeciorzędowej, kilka pętli, które są ważne dla jej złożenia w polimeryczną F-aktynę. Pętle te ulegają zmianom konformacyjnym w zależności od stanu związanego nukleotydu lub służą jako regiony dla sąsiednich monomerycznych jednostek aktyny do wiązania się z nimi. Działają one jak „przełącznik” konformacji, w zależności od związanego nukleotydu. Reszty pętli wiążącej DNAse I (40-50) oprócz tego, że ulegają zmianom konformacyjnym wpływającym na stabilność, wiążą enzymy DNAse I i przypuszcza się, że utrzymują DNAse I. Pętla hydrofobowa , obejmująca reszty 264-273, oraz pętla , obejmująca reszty 165-172, funkcjonują jako miejsca, do których mogą się wiązać sąsiednie monomery D-pętli aktyny. Podobną funkcję pełnią reszty (374-375).

Przedstawiona tu cząsteczka F-aktyny składa się z 375 reszt (43kDa) i dwóch ligandów, ADP i Ca2+. Posiada dwie główne domeny oddzielone szczeliną wiążącą nukleotydy. W zależności od stanu związanego nukleotydu zmienia się najbardziej stabilna konformacja F-aktyny. W stanie związanym z nukleotydami ATP i ADP + Pi ma ona zamkniętą szczelinę wiążącą. Charakterystyczną cechą aktyny jest to, że domeny pozostają skręcone względem siebie, pomimo zmian konformacyjnych zależnych od stanu nukleotydów.

Polimer F-aktyny (na podstawie struktury F-aktyny Kena Holmesa)

Polimer

F-aktyna ma wygląd dwóch prawoskrętnych heliksów, stopniowo skręconych wokół siebie. W rzeczywistości składa się z powtórzeń 13 jednostek aktyny na każde 6 lewoskrętnych skrętów, rozciągając się na długości 350 Å.

Zależne od stanu nukleotydu zmiany konformacyjne

Stan związanego fosforylowanego nukleotydu wpływa na to, jaką konformację przyjmuje monomer F-aktyny. Obecność gamma-fosforanu w miejscu aktywnym powoduje rotację reszty Ser14. Zmiana ta prowadzi do przesunięcia zmetylowanej histydyny (HIC73), co zmienia miejsce aktywne F-aktyny i powoduje zmianę konformacyjną pętli D. HIC73 znajduje się w „pętli sensorowej”, czyli „przełączniku” łączącym zmiany w związanym nukleotydzie ze zmianami konformacyjnymi. W ATP-aktynie i ADP-Pi-aktynie pętla D jest niestrukturalna. W związanej z ADP formie F-aktyny, helisa alfa jest powszechnie widoczna w pętli D monomeru.

Ale chociaż helisa alfa nie jest obserwowana w tym modelu Oda F-aktyny i nie jest widoczna w niektórych innych badaniach F-aktyny, to jest uznawane przez Oda et. al, że wyniki eksperymentalne mogły prowadzić do rozszerzonej helisy alfa w modelu, w przeciwieństwie do rozszerzonego nieuporządkowanego pasma jako segmentu interakcji między jednostkami monomerycznymi F-aktyny.

Domeny

(2zwh)

Struktura pojedynczej jednostki F-aktyny powstaje z jednego łańcucha polipeptydowego z dwiema domenami. Pomiędzy tymi dwoma domenami można zaobserwować szczelinę wiążącą nukleotydy, miejsce hydrolizy ATP. Ruch domen umożliwia powstawanie otwartych i zamkniętych konformacji F-aktyny.

Ruch domen jest możliwy dzięki rotacji wokół , pokazanej na fioletowo. Według Oda i wsp., podczas przejścia z G- do F-aktyny, uważa się, że domena 2 przechyla się o 20° i dopasowuje się do domeny 1, dając w ten sposób bardziej płaską konformację niż wolna G-aktyna. Nie jest pewne, czy to spłaszczenie następuje przed czy po hydrolizie ATP. Holmes przedstawia uproszczony obraz tego ruchu domeny i spłaszczenia.

Stabilność

Spłaszczona sfałdowana forma F-aktyny wymaga innych mechanizmów stabilizacji niż wolna monomeryczna forma G-aktyny. Stabilność kompleksu F-aktyny jest osiągana przez szereg mechanizmów obejmujących argininę 206, 183, 177 (fioletowy); glutaminian 72 (niebieski), asparaginian 187 (zielony), 179 i 4-metylohistydynę 73 (żółty). Uważa się, że dodatkowa stabilność wynika z przerwy w interakcji pomiędzy resztami w tej samej połowie ich odpowiednich domen na rzecz nowej interakcji pomiędzy, gdzie obserwuje się znacznie większą odległość pomiędzy nimi.

Po uwolnieniu Pi, zmiana konformacyjna na pętli D powoduje „zmiękczenie” filamentu F-aktynowego. Oznacza to, że czyni monomer ADP-aktyny bardziej niestabilnym i czyni go bardziej podatnym na rozszczepienie

Active Site

Upon actin binding on the plus end of the actin filament, the ATPase function is activated. Zmiana konformacyjna z G- na F- aktynę promuje aktywność katalityczną z powodu przesunięcia o 20° prowadzącego do bardziej zamkniętego miejsca wiązania; ta zmiana konformacyjna jest stabilizowana również przez diagonalne oddziaływanie subdomenowe między Leu110 i Thr194. W wyniku tych zmian konformacyjnych aktyna jest przesunięta bliżej ligandu ATP-Ca2+. Gln137 posiada cząsteczkę wody, a umieszczenie jej w bliskim sąsiedztwie ATP umożliwia rozszczepienie gamma-fosforanu. Uwolnienie fosforanu nieorganicznego następuje poprzez zmianę konformacyjną elastycznej „pętli D” w uporządkowaną helisę alfa (choć nie wykazano tego w tym modelu).

Funkcja

F-aktyna pełni rolę strukturalną, mechaniczną i enzymatyczną w komórkach eukariotycznych. Funkcje te niekoniecznie wykluczają się wzajemnie.

Dynamiczne funkcje f-aktyny są silnie zaangażowane w migrację komórek.

Cytoszkielet

F-aktyna jest najobficiej występującym składnikiem cytoszkieletu eukariotów. Zapewnia duże ilości wytrzymałości na rozciąganie, biorąc pod uwagę jej cienkie rozmiary. W przypadkach, gdy elastyczność nie jest pożądana jako składnik strukturalny, można utworzyć wiązania krzyżowe między polimerami F-aktyny w celu uzyskania większej sztywności i wsparcia.

Przedłużenie gałęzi F-aktyny prowadzi do zjawiska wypychania błony plazmatycznej do przodu w rozszerzeniu lamelopodialnym i filopodialnym. Proces ten opiera się na dynamicznym stanie równowagi, w jakim znajduje się G- i F-aktyna, gdyż to właśnie ciągła polimeryzacja jednostek aktyny na krawędzi wiodącej napędza rozszerzanie błony. Bez enzymatycznej funkcji ATPazy F-aktyny, proces ten nie byłby możliwy.

Aktyna-Miozyna

Względnie bardziej płaski kształt F-aktyny w porównaniu do G-aktyny pozwala miozynie preferencyjnie wiązać F-aktynę w stosunku do G-aktyny. Oznacza to, że F-aktyna, a nie G-aktyna, jest funkcjonalną formą aktyny. Stanowi ona znaczną część cienkich filamentów, które w połączeniu z miozyną dają skurcze mięśni. Struktura F-aktyny daje jej dużą odporność na rozległe siły, takie jak te doświadczane w skurczu mięśni.

.