Evolutionary analysis of gyrA gene from Neisseria meningitidis bacterial strains of clonal complex 4821 collected in China between 1978 and 2016

Evolutionary analysis of 77 gyrA nucleotide sequences from CC4821 N.meningitidis strains

Siedemdziesiąt siedem sekwencji de novo gyrA ze szczepów CC4821 N.meningitidis przeanalizowano w kontekście 149 publicznie dostępnych sekwencji gyrA (wymienionych w Dodatkowej Tabeli 1). Z uzyskanego zbioru 226 sekwencji nukleotydowych gyrA skonstruowano drzewo filogenetyczne metodą łączenia sąsiadów (Rys. 1). Podobne drzewo otrzymano stosując metodę największej wiarygodności (ML) (Dodatkowa Rycina 1). Sekwencje nukleotydowe były znacząco rozbieżne z ogólną odległością p wynoszącą 0,045 (Tabela 1). Przegląd drzewa wykazał, że sekwencje ze szczepów CC4821 N.meningitidis (na czerwono na Rys. 1) znajdowały się w poprzek drzewa, co świadczy o tym, że gen gyrA był stosunkowo rozbieżny w obrębie tych szczepów.

Neighbor joining phylogenetic tree of 226 gyrA gene sequences from Neisseria strains. Nazwa szczepu jest oznaczona w następujący sposób: nazwa gatunku-GB ID- szczep ID-ST-CC-Serogrupa-country of collection-year of collection-CIP resistance phenotype. Brakująca informacja jest wskazywana przez puste miejsce. Na przykład, N.meningitidis-AM889136.1-alpha14-ST53-CC53-cnl-Niemcy-1999 S; Eikenella corrodens-CP034670.1-KCOM3110—-Korea Południowa-2017. Czerwoną czcionką zaznaczono nazwy sekwencji ze szczepów CC4821 N.meningitidis. Podkreślono 77 sekwencji wygenerowanych w tym badaniu. Sekwencje 9 szczepów referencyjnych zaznaczone są czarną kropką. Wartości Bootstrap > 70% są zaznaczone. Wartości Bootstrap < 70% są wskazane w nawiasie, gdy jest to konieczne. 9 grup genetycznych zidentyfikowanych w tym badaniu jest oznaczonych jako pionowe linie w nawiasach. Fenotyp odporności na CIP oznaczono literami R dla fenotypu odporności, S dla fenotypu wrażliwego i I dla fenotypu odporności pośredniej

Pośród 226 analizowanych sekwencji, prawie 62% sekwencji (140) znalazło się na szczycie drzewa, bez istotnych wartości bootstrap (Rys. 1). Sekwencje te były wysoce homogeniczne, z odległością p wynoszącą 0,003 (tab. 1). Pozostałe 86 sekwencji było bardziej rozbieżnych, z odległością p 0,066 w stosunku do sekwencji zgrupowanych na szczycie drzewa. Większość węzłów dotyczących tych 86 sekwencji posiadała wartość bootstrap > 70%. Ponadto p-distance w obrębie tej grupy 86 sekwencji wynosił 0,09 wykazując, że sekwencje te były wysoce rozbieżne między sobą. Ponieważ główne węzły drzewa charakteryzowały się wartością bootstrap > 80%, postanowiliśmy arbitralnie przypisać sekwencje do 9 różnych grup genetycznych (Ryc. 1; Tab. 1). Te 9 grup znalazło się również w drzewie ML (Dodatkowa Rycina 1). Sekwencje gyrA ze szczepów CC4821 znaleziono w 6 z tych grup genetycznych, a mianowicie w grupie 1, 2, 3, 5, 6 i 8.

Grupa 1 składała się z 2 sekwencji, N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 i N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009. Grupa ta została poparta bootstrapem 100% sugerującym, że te 2 sekwencje bardzo różniły się od reszty sekwencji. Sekwencje te miały 7 wspólnych zmian aminowych (Tabela 1, Dodatkowa Tabela 2). Jednakże, długa gałąź odpowiadająca sekwencji N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009 sugerowała, że ta sekwencja była również znacząco rozbieżna z N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 i zostało to potwierdzone przez p-distance 0.06 pomiędzy tymi 2 sekwencjami (Tabela 1).

Grupa 2 składała się z 2 sekwencji pochodzących od szczepów N.meningitidis zebranych w prowincjach Gansu i Guangxi w Chinach w 2007 i 2011 roku, mianowicie N.meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R i N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011.

Grupa 3 składała się z pojedynczej sekwencji, a mianowicie N.meningitidis-MK930402-231003-ST12300-CC4821-B-China-2009. Węzeł odpowiadający tej sekwencji został poparty wartością bootstrap 80%. Ponadto najniższa odległość p między tą sekwencją a innymi analizowanymi sekwencjami wynosiła 0,032, co świadczy o tym, że sekwencja ta była istotnie rozbieżna w stosunku do reszty analizowanych sekwencji (Tabela 1).

Grupa 5 składała się z 26 sekwencji, głównie z N.meningitidis, w tym 9 z CC4821. W podgrupie 7 sekwencji wspartych bootstrapem 100% znalazło się 5 sekwencji z N.lactamica. Co ciekawe, N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 grupował się z sekwencjami N.lactamica z bootstrapem 100% i długą gałęzią.

Grupa 6 składała się z 27 sekwencji od N.meningitidis (8 z CC4821) i 1 sekwencji z N. cinerea, mianowicie N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294, która dzieliła węzeł z N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R. Jednakże sekwencja N.cinerea posiadała długą gałąź sugerującą znaczną dywergencję w porównaniu z sekwencją N.meningitidis. Na podstawie dostępnych danych wydaje się, że sekwencje z grupy 6 pochodziły ze szczepów opornych na CIP. Jednakże, żadna unikalna substytucja aminokwasowa nie była wspólna dla tych szczepów, co sugeruje, że nie było wspólnego markera dla fenotypu oporności tych szczepów (Dodatkowa Tabela 2).

Grupa 8 zawierała większość sekwencji N.meningitidis (64%) analizowanych w tym raporcie. Szczepy te zostały zebrane w ciągu ostatnich 88 lat w 13 różnych krajach z 4 kontynentów. Pomimo znacznej rozpiętości czasowej i geograficznej, sekwencje te charakteryzowały się wysokim stopniem konserwatywności z odległością p 0,003. Ponadto, sekwencje te pochodziły ze szczepów 68 ST, 24 CC, 9 grup serologicznych, w tym szczepu referencyjnego 053442. Ogólnie, obserwacje te wykazały, że gen gyrA był wysoce konserwowany wśród większości szczepów N.meningitidis pomimo różnych cech genetycznych, lokalizacji geograficznych lub czasu zbierania.

Analiza dywergencji w obrębie białka GyrA

Dywergencja aminokwasowa w obrębie białka GyrA była analizowana wśród 129 unikalnych sekwencji (Dodatkowa Tabela 2). Zidentyfikowano dwieście pięćdziesiąt siedem rozbieżnych pozycji wśród 931 aminokwasów występujących w wyrównaniu (ryc. 2). Mimo że miejsca te występowały w całym białku, rozkład rozbieżności nie wydawał się przypadkowy. Istotnie, dwa regiony były silnie konserwowane, od pozycji 530 do 620, oraz mniejszy region pomiędzy 300 i 330. Według białka z E.coli, pierwszy region odpowiada końcowi domeny terminalnej aminowej i początkowi domeny terminalnej karboksylowej. Drugi region odpowiada domenie wieżowej białka w oparciu o modelową strukturę 3D (Rys. 2).

Dywergencja aminokwasowa wśród białek GyrA w oparciu o 129 unikalnych sekwencji. Pozycje w obrębie 932 aminokwasów są zaznaczone na osi X. Na osi Y (po lewej stronie) zaznaczono procent sekwencji charakteryzujących się daną rozbieżną pozycją. Na przykład, 58% sekwencji zawiera mutację w pozycji 91. Wykres dywergencji został wygenerowany na podstawie tabeli różnic aminokwasowych przedstawionej w Tabeli Dodatkowej 2. W wyrównaniu występuje 10 luk, a liczba sekwencji z lukami jest zaznaczona na prawej osi i przedstawiona jako czarny kwadrat. Na dole pokazano dla porównania mapę białka E.coli GyrA zawierającą domeny strukturalne i funkcjonalne. Mapa została wygenerowana w oparciu o następujące źródła. Porównano sekwencję białka GyrA E.coli i referencyjnego szczepu N.meningitidis 053442 (GB-ID CP000381) (Dodatkowa Tabela 4). Pokazano znane miejsca oporne na CIP u E.coli, a odpowiadające im pozycje u N.meningitidis zaznaczono niebieską linią. Warto zauważyć, że spośród 8 miejsc opornych opisanych u E.coli, tylko pozycje 83 i 87 są rozbieżne u N.meningitidis (pozycje 91 i 95)

Pośród 257 rozbieżnych pozycji, żadna nie była wspólna dla wszystkich analizowanych sekwencji gyrA szczepów CC4821. Pięć miejsc (91, 417, 665, 210 i 288) było wysoce rozbieżnych, 40% lub więcej ze 129 sekwencji było zmutowanych w tych pozycjach. Na przykład, 48% ze 129 sekwencji zawierało zmutowaną resztę w pozycji 417 (Rys. 2). Jedna pozycja (91) wydawała się być powiązana z opornością na CIP, wszystkie szczepy, które nie były wrażliwe na CIP były zmutowane w tej pozycji, zawierając albo I, albo F, albo V (Dodatkowa Tabela 2).

Identyfikacja potencjalnych markerów oporności na CIP

Wśród 226 analizowanych sekwencji, 174 pochodziły ze szczepów testowanych pod kątem oporności na CIP (Dodatkowa Tabela 1). W niniejszej pracy przebadano 67 szczepów. Jak wspomniano powyżej, wszystkie szczepy, które nie były wrażliwe na CIP (albo z fenotypem opornym (R w drzewie), albo z fenotypem pośrednim (I w drzewie)) miały mutację w pozycji 91. Pokazało to, że mutacja w pozycji 91 była związana z mechanizmem oporności. Wśród 67 szczepów badanych w tym badaniu, 49 było zmutowanych w pozycji 91, ale 23 z tych szczepów miało fenotyp pośredniej oporności. Sugerowało to, że inne pozycje mogą być zaangażowane w mechanizm oporności. W celu zidentyfikowania dodatkowych potencjalnych markerów oporności, 226 szczepów poddano dalszej analizie pod kątem każdej zmutowanej pozycji. Kwalifikowano zmianę, która występowałaby w szczepach opornych (łącznie z fenotypem oporności pośredniej), ale nie występowałaby w żadnych szczepach wrażliwych. Jednakże, aby zwiększyć rygorystyczność analizy, mutacja znaleziona tylko w jednym szczepie nie byłaby brana pod uwagę. Ogółem zidentyfikowano 33 miejsca (Dodatkowa Tabela 3; lewa strona Dodatkowej Tabeli 4). Na przykład, H8N znaleziono w 18 opornych szczepach (w tym 2 z pośrednim fenotypem), ale nie występowała w żadnych wrażliwych szczepach. Wszystkie 226 szczepów zostało przeanalizowanych pod kątem tych 33 pozycji. Ponownie, aby zwiększyć rygorystyczność analizy, mutacja znaleziona w co najmniej jednym wrażliwym szczepie zostałaby odrzucona. Tak więc, mutacja D95N znaleziona w szczepach opornych i wrażliwych nie była dalej rozpatrywana. W sumie przeanalizowano 39 mutacji (niektóre w tej samej pozycji, jak np. pozycja 91) (na zielono po lewej stronie tabeli dodatkowej 4). Zbudowano profil mutacji dla 128 szczepów, w których występowała co najmniej jedna interesująca nas mutacja (Dodatkowa Tabela 3). Zidentyfikowano czterdzieści sześć różnych profili, co oznacza, że istniało 46 kombinacji tych 39 mutacji wśród wszystkich analizowanych szczepów (prawa strona Dodatkowej Tabeli 4). Szesnaście z 46 profili mutacji dotyczyło szczepów CC4821 (numery w kolorze czerwonym w Dodatkowej Tabeli 4). Dwadzieścia sześć profili dotyczyło szczepów, o których wiadomo, że są oporne na CIP (nazwy szczepów wyróżnione niebieską czcionką w Dodatkowej Tabeli 4). Spośród 39 potencjalnych markerów oporności, mutacje N103D i T91I były najczęściej współdzielone w profilach, odpowiednio 29 i 27 wystąpień. Warto jednak zauważyć, że inne mutacje również były dobrze reprezentowane, jak H8N, I111V, E793Q i A679S z odpowiednio 23, 21, 18 i 17 wystąpieniami. Warto również zauważyć, że 45% szczepów opornych (58 ze 128) posiadało tylko mutację T91I. Ponieważ markery oporności zostały początkowo opisane u E.coli, konieczne było porównanie sekwencji gyrA u E.coli i szczepu referencyjnego N.meningitidis 53,442 w celu sprawdzenia pozycji tych markerów w sekwencji E.coli (Dodatkowa Tabela 5).

Rekombinacja w obrębie genu gyrA pomiędzy N. spp.

Analiza filogenetyczna zidentyfikowała potencjalne rekombinanty. Szczególnym zainteresowaniem cieszyła się grupa 1, dotycząca N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 i N.subflava-CP031251.1-M18660. Te 2 sekwencje miały 7 wspólnych zmian reszt, nie obserwowanych u innych szczepów. Co więcej, 5 z tych zmian było widocznych w obrębie 30 aminokwasów (Tabela 1). Wreszcie, zmiany aminokwasowe zaobserwowane w jednym szczepie nie były widoczne w drugim, jak np. pozycja 740 i 750. Wszystkie te obserwacje sugerowały rekombinację pomiędzy tymi 2 szczepami, co zostało potwierdzone analizą BootScan (Rys. 3a). Trzy inne potencjalne rekombinacje zostały potwierdzone przez BootScan. Rys. 3b opisywał rekombinację pomiędzy szczepem CC4821 (prawdopodobnie N.meningitidis-MK930428-421615-ST10235-CC4821-B-China-2016 lub N.meningitidis-CP000381.1-053442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R) i N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294 —–. Rys. 3c przedstawia liczne zdarzenia rekombinacyjne pomiędzy N.lactamica-CP031253.1-M17106—– i dwoma szczepami N.meningitidis, N.meningitidis-KJ415206.1-54-R6—– i N.meningitidis-CP000381.1-53,442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R. Wreszcie na ryc. 3d przedstawiono rekombinację między szczepami N.meningitidis. W sumie, analiza rekombinacji wykazała, że gen gyrA szczepów Neisseria jest wysoce podatny na rekombinację.

Potencjalne zdarzenia rekombinacyjne między- i wewnątrzgatunkowe wśród szczepów Neisseria. a. Rekombinacja między N.subflava i N.meningitidis. Wykres BootScan został wygenerowany w SimPlot z N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 jako zapytanie. b. Rekombinacja pomiędzy N.cinerea i N.meningitidis. Wykres BootScan został wygenerowany w SimPlot z N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R jako zapytanie. c. Rekombinacja pomiędzy N.lactamica i N.meningitidis. Wykres BootScan został wygenerowany w SimPlot z N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 jako zapytanie. d. Rekombinacja pomiędzy szczepami N.meningitidis. Wykres BootScan został wygenerowany w SimPlot z N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011 jako zapytaniem. Szczep, który według przewidywań ma największy udział w procesie rekombinacji (szkielet) jest zaznaczony czerwoną linią. Referencyjny szczep N.meningitidis 053442 (GB ID CP000381) jest zaznaczony czarną linią. Powyżej przedstawiono mapę funkcjonalną dla szczepu referencyjnego 053442 w oparciu o mapę funkcjonalną E.coli przedstawioną na Rys. 2

.