Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation (ERAD)

2.1 Proces fałdowania białek i rozpoznawanie źle złożonych białek

Około 30% wszystkich białek i wszystkie białka transmembranowe komórki są syntetyzowane w ER, które działa jako portal dla wejścia do szlaku wydzielniczego przez kanał Sec61 . Podczas translokacji, N-końcowa hydrofobowa sekwencja sygnałowa nowo syntetyzowanego białka jest rozszczepiana przez kompleks peptydaz. Co- i posttranslacyjne modyfikacje, takie jak tworzenie wiązań disiarczkowych, początkowe etapy N-glikozylacji i zakotwiczenie glikofosfatydyloinozytolu (GPI) zachodzą w ER.

Utleniające środowisko ER wspomaga tworzenie wiązań disiarczkowych, co stabilizuje trzeciorzędową strukturę białka i ułatwia składanie białka. Podczas procesu fałdowania, wiązania disiarczkowe są tworzone poprzez utlenianie par wolnych tioli na resztach cysteinowych przez izomerazy disiarczkowe białek (PDIs). PDI działają jak cykle i po wstępnym utlenieniu, wiązania disiarczkowe są czasami izomeryzowane przez PDI i ERp57, która jest oksydoreduktazą tiolową, w celu stabilizacji prawidłowego składania białka . I odwrotnie, redukcja wiązań disiarczkowych błędnie złożonych białek jest niezbędna dla etapu retrotranslacji w ERAD. Istotnie, PDI umożliwia retrotranslację wirusa simian virüs-40 (SV-40) i toksyny cholery. ERdj5, oksydoreduktaza ER, redukuje wiązania disulfidowe i oddziałuje z EDEM (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein) i również przyspiesza etap retrotranslacji SV-40. ERDJ5 reguluje również degradację chorobotwórczego wariantu α1-antytrypsyny (null Hong Kong) .

Folding jest wspomagany przez chaperony molekularne, które chronią przed błędnym składaniem i rozkładaniem. Chaperone-like glikany wiążą się z N-glikanami odgrywającymi kluczową rolę w składaniu i degradacji białek. Jest oczywiste, że N-glikozylacja, kontrola jakości fałdowania białek i ERAD są funkcjonalnie powiązane. Po dostaniu się do ER większość nowo zsyntetyzowanych łańcuchów polipeptydowych ulega N-linkowanej glikozylacji. Enzym oligosacharylotransferaza rozpoznaje sekwencję konsensusową Asn-X-Ser/Thr w większości powstającej cząsteczki białka i kowalencyjnie przyłącza do białka grupy glikanowe o wysokiej zawartości mannozy (Glc3Man9GlcNAc2) pochodzące z dolicholu zlokalizowanego na błonie ER. Ze względu na bardzo krótki okres półtrwania triglikozylowanej formy oligosacharydu związanego z białkiem, przetwarzanie glikanu rozpoczyna się natychmiast po przeniesieniu prekursorowych grup glikanowych przez enzymy glukozydazy. Po rozszczepieniu dwóch z trzech reszt glukozowych, powstające białko może oddziaływać z lektynami kontrolującymi jakość, takimi jak CNX i CLR. Interakcja ta jest zachowana do momentu rozszczepienia pozostałej reszty glukozowej. Po uwolnieniu glikoproteiny z cyklu CNX/CLR, końcowa glukoza jest również obcinana, tworząc nieglikozylowany substrat. Utrudnia to oddziaływanie substratu z chaperonami lektynowymi. Na tym etapie, jeśli białko jest prawidłowo złożone, może opuścić ER i udać się do miejsca docelowego. Jeśli jednak glikoproteina jest nadal nieuformowana, zostaje zatrzymana w ER i ulega reglukozylacji przez glukozylotransferazę UDP-glukoza:glikoproteina oraz odbiciu z CNX i CLR, co daje białku więcej czasu na prawidłowe złożenie. Mechanizmy bior±ce udział w zakończeniu cykli reglikozylacji/deglikozylacji nie s± jeszcze poznane. Wiadomo jednak, że jeśli łańcuch polipeptydowy nie może osiągnąć swojej dojrzałej formy po wielokrotnych próbach składania, terminalne reszty mannozy z rdzenia łańcucha glikanowego są stopniowo usuwane przez ER α1,2-mannozydazę I (ERMan1). ERMan1 wytwarza izomer Man8GlcNAc2 poprzez usunięcie reszty mannozowej ze środkowej gałęzi N-glikanów. Przez to przycinanie, glikoproteina staje się gorszym substratem dla reglikozylacji i wyjścia z cyklu CNX .

Hydrofobowe łaty prawidłowo sfałdowanych białek są zwykle pochowane we wnętrzu rozpuszczalnych białek. Jednakże, te łaty mogą być narażone w źle złożonych białek. Jeśli białko ma odsłonięte powierzchnie hydrofobowe, BiP wiąże się z nim w celu ukrycia tych podatnych na agregację powierzchni dla prawidłowych prób składania poprzez zapobieganie agregacji. Jeśli jednak fałdowanie nie powiedzie się lub zostanie opóźnione, rozszerzona interakcja chaperon-nieprawidłowe białko służy do wyrafinowanego procesu, w którym białko jest przenoszone do innych chaperonów i/lub do procesu ERAD.

Przyjęło się uważać, że pierwszym krokiem ERAD jest selekcja błędnie złożonych białek przez chaperony. Już w 1999 r. stwierdzono, że substraty ERAD drożdży uderzająco różniły się w swoim zapotrzebowaniu na Hsp70, BiP. Degradacja substratów rozpuszczalnych, takich jak pαF i zmutowana forma wakuolarnej proteazy karboksypeptydazy Y* (CPY*), była zależna od BiP, podczas gdy degradacja białek transmembranowych Pdr5*p, Ste6-166p, Sec61-2p i Hmg2p zachodziła w sposób niezależny od BiP. W 2004 r. wykazano, że substraty z domeną cytozolową, takie jak Ste6-166p, były degradowane BiP-niezależnie, podczas gdy białka z defektami luminalnymi wymagały BiP, co sugeruje, że w zależności od topologii błędnie złożonej zmiany (światło ER, błona ER i cytoplazma) chaperony cytozolowe lub luminalne funkcjonują w rozpoznawaniu i kierowaniu do degradacji .

Możliwe jest badanie rozpoznawania substratów podczas ERAD przy użyciu modelowych błędnie złożonych białek. Jest jasne, że de-mannozylacja jest wymagana do degradacji błędnie uformowanych glikoprotein, ponieważ hamowanie tego przycinania mannozy stabilizuje błędnie uformowane glikoproteiny w ER. Nadekspresja ERMan1 przyspiesza degradację N-glikozylowanych białek. Powstała glikoproteina zawierająca Man8-GlcNAc2 po tym przycięciu staje się substratem dla EDEM1 (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein 1, Htm1p w drożdżach) – lektyny związanej z mannozydazą w ER. Następnie zaproponowano, że błędnie złożone glikoproteiny oddziałują z ERManI i EDEM1 w celu ich ERAD, a interakcja lektyna-węglowodan okazała się kluczowa dla rozpoznania substratu EDEM. Chociaż sugerowano, że ERMan1 jest biologicznym zegarem inicjującym ERAD błędnie złożonych białek, ostatnie badania ujawniły, że mannozydazy nie są wyłącznie odpowiedzialne za intensywną demannozylację podczas ERAD, szczególnie w warunkach niebazowych. W warunkach stresu ER (unfolded protein response active) transkrypcyjne podwyższenie EDEM1 zwiększa wydajność ERAD poprzez tłumienie proteolitycznej downregulacji ERMan1. Okazało się, że EDEM odgrywają również ważną rolę w demannozylacji substratów. EDEM1 zapobiega również reglikozylacji oraz promuje retrotranslację i degradację niektórych substratów ERAD. Z drugiej strony, podczas gdy domena homologii mannozydazy (MHD) Htm1p jest niezbędna do wiązania substratów, ssaki EDEM1 wiążą błędnie uformowane białka niezależnie od domeny MHD, a zatem wiązanie substratów przez EDEM1 może nie wymagać przycinania mannozy lub nawet glikozylacji. Tak więc, oprócz N-linkowanych oligosacharydowych cząsteczek glikoprotein, EDEM1 może rozpoznawać zmiany w składaniu źle złożonych białek. Podsumowując, EDEM są bezpośrednio lub pośrednio zaangażowane w demannozylację glikoprotein i/lub służą jako receptory, które wiążą i ukierunkowują białka pozbawione mannozy na ERAD (Rysunek 1).

Truncacja terminalnej mannozy z gałęzi C odsłania reszty α terminalne α1,6 wiązania mannozy funkcjonujące jako sygnał rozpoznawczy dla lektyn ERAD, takich jak OS9 (Yos9 w drożdżach) i XTP3-B (Figura 2). Poprzez swoją domenę homologii receptora mannozy-6-fosforanu (MRH), oba białka rozpoznają przede wszystkim α1,6-połączone reszty mannozy j. Dodatkowo OS-9 rozpoznaje również α1,6-połączone reszty mannozy e i c .

Kilka doniesień sugeruje, że czynniki (EDEMs, OS9 i XTP3-B) wymagane do rozpoznawania i ukierunkowania substratu rezydują w kompleksach supramolekularnych i/lub oddziałują z ważnymi regulatorami ERAD . Na przykład EDEM1 oddziałuje z CNX, odbiera substraty z cyklu CNX i ułatwia degradację substratów ERAD, takich jak mutant NHK-α1-antytrypsyny . EDEM1 łączy się również z komponentami maszynerii retrotranslokacyjnej ER. Sugeruje się, że EDEM1 wiąże źle złożone białka i wykorzystuje swoją domenę MHD do kierowania nieprawidłowych białek do rezydującej w ER glikoproteiny SEL1L należącej do kompleksu ligazy ubikwitynowej Hrd1-SEL1L. SEL1L rusztowania kilka luminalnych czynników rozpoznawania substratów i łączy je z Hrd1. OS9 i XTP3-B również łączą się z kompleksem Hrd1-SEL1L, który obejmuje również BiP i GRP94. Ponadto proponuje się, aby XTP3-B łączył BiP z kompleksem Hrd1 . Według jednej z hipotez, te trzy chaperony (EDEM1, OS9 i XTP3-B) funkcjonują jako oligomery, gdzie jeden monomer oddziałuje z substratem, a drugi z kompleksem Hrd1-SEL1L. Ponadto EDEM1 oddziałuje również z Derlins, białkiem transmembranowym, które jest kandydatem na translokon; ponadto wykazano, że Derlin2 zwiększa interakcję EDEM1 z cytozolową AAA-ATPazą p97, która sprzęga hydrolizę ATP z retrotranslacją źle złożonych białek .

Jasne jest, że etap rozpoznawania substratu w ERAD jest skomplikowanym mechanizmem, w którym bierze udział kilka różnych enzymów i chaperonów mających odrębne, ale zgodne role w ERAD. Co więcej, w zależności od substratów, liczba i cechy zaangażowanych białek różnią się. Na przykład, sugeruje się współdziałanie EDEM, ERdj5 i BiP w degradacji źle złożonych białek. Po wyjściu z cyklu CNX-CLR, EDEM1 dalej trymuje strukturę glikanu Man8-GlcNAc2, a ERdj5 redukuje wiązania disulfatowe. Równocześnie ERdj5 aktywuje aktywność ATPazy BiP. Związany z ADP BiP wiąże się z błędnie złożonym białkiem i utrzymuje je w formie komponentu retrotranslokacji, dopóki nie przeniesie się do kompleksu retrotranslokacji .

ERAD jest również zaangażowany w kontrolę jakości białek nieglikozylowanych, która jest niezależna od białek podobnych do lektyn. Łańcuch lekki immunoglobuliny (Ig-K-LC), nieglikozylowany substrat ERAD, jest degradowany w sposób zależny od BiP. Okuda-Shimizu i Hendershot scharakteryzowali szlak ERAD dla tego nieglikozylowanego substratu BiP i różne dynamiki interakcji białkowych, które odgrywają rolę w tym procesie. Ig-K-LC posiada dwa wewnątrzcząsteczkowe wiązania disiarczkowe, a jego w pełni utleniona forma nie ma zdolności przechodzenia z ER do cytoplazmy. BiP oddziałuje tylko z częściowo utlenioną formą Ig, zapobiegając pełnemu utlenieniu Ig-K-LC i tym samym ułatwiając jej uwolnienie z ER. Ponadto, transmembranowe białko zawierające domenę UBL, homoCys-responsive ER-resident protein (HERP), zostało uznane za receptor dla nieglikozylowanych substratów BiP. HERP oddziałuje z Derlin1, a częściowo utleniony Ig-K-LC jest przenoszony z BiP do kompleksu HERP-Derlin1-Hrd1, a następnie kierowany do degradacji proteasomalnej. Oprócz BiP, ERdj5 jako reduktaza disulfidowa jest również istotna dla ERAD białek nieglikozylowanych. Nieglikozylowane substraty wychwytywane przez BiP są przenoszone do ERdj5 w celu rozszczepienia wiązań disiarczkowych. Następnie substraty te są przenoszone do SEL1L za pomocą BiP w celu retrotranslokacji. Oprócz BiP, zarówno OS9 jak i XTP3-B zostały zaangażowane w ERAD białek nieglikozylowanych .

.