ELISpot Assay Principle

Testy ELISpot wykorzystują technikę kanapkowego enzymatycznego testu immunosorbcyjnego (ELISA). Przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne specyficzne dla wybranego analitu jest wstępnie nanoszone na mikropłytkę pokrytą PVDF (polifluorek winylidenu). Odpowiednio stymulowane komórki są pipetowane do dołków, a mikropłytka jest umieszczana w nawilżanym inkubatorze 37 °C CO2 na określony okres czasu. Podczas tego okresu inkubacji, unieruchomione przeciwciało, w bezpośrednim sąsiedztwie wydzielających komórek, wiąże wydzielany analit. Po wypłukaniu wszelkich komórek i niezwiązanych substancji, do dołków dodaje się biotynylowane przeciwciało poliklonalne specyficzne dla wybranego analitu. Po płukaniu w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych biotynylowanych przeciwciał, dodaje się alkaliczno-fosfatazę sprzężoną ze streptawidyną. Niezwiązany enzym jest następnie usuwany przez płukanie i dodawany jest roztwór substratu (BCIP/NBT). Tworzy się niebiesko-czarny osad i pojawia się w postaci plamek w miejscach lokalizacji cytokin, przy czym każda pojedyncza plamka reprezentuje pojedynczą komórkę wydzielającą analit. Plamki mogą być liczone za pomocą automatycznego systemu czytnika ELISpot lub ręcznie, przy użyciu stereomikroskopu.

.