Elektroporacja i konkurencyjne metody transfekcji

Oprócz bezpośredniego wprowadzania genów, elektroporacja ułatwia bezpośrednie przenoszenie plazmidów między komórkami lub gatunkami – na przykład z bakterii do drożdży.

Dalej trwają intensywne eksperymenty nad wykorzystaniem elektroporacji do dostarczania leków i szczepionek bezpośrednio do komórek żywych organizmów. Ten artykuł skupia się na zastosowaniach niemedycznych.

Elektroporacja jest najczęściej używana do transfekcji komórek przejściowo, chociaż możliwa jest również transfekcja stabilna. W przemyśle biofarmaceutycznym, transfekcja przejściowa umożliwia produkcję do kilku gramów białka do charakteryzacji i badań przedklinicznych. W tym zastosowaniu elektroporacja wykorzystująca plazmidy okazała się być niezawodna i przewidywalna. Elektroporacja podobnie wytwarza stabilnie transfekowane komórki, pod warunkiem, że DNA jest wprowadzane w formie zlinearyzowanej poprzez uprzednie potraktowanie go enzymem restrykcyjnym.

Jedna technika spośród wielu

Elektroporacja jest mocno osadzona w armamentarium technik transfekcji, które obejmują wektory wirusowe, metody chemiczne lub oparte na odczynnikach oraz mechaniczne dostarczanie genów. Wektory wirusowe są najbardziej rozpowszechnioną metodą generowania stabilnie transfekowanych komórek do produkcji białek terapeutycznych. Wektory wirusowe zapewniają bardzo wysoką skuteczność transfekcji, ale są ograniczone pod względem długości wprowadzanego DNA. Wektory wirusowe napotykają również na problemy związane z bezpieczeństwem biologicznym i mutagenezą.

Inne techniki mechaniczne, takie jak mikroprecypitacja, mikroiniekcja, liposomy, bombardowanie cząsteczkami, sonoporacja, poracja indukowana laserem i transfekcja paciorkami są stosowane eksperymentalnie. Te mechaniczne techniki mają wspólną cechę. Zaburzają one błony komórkowe i w ten sposób umożliwiają wniknięcie DNA do komórki. Niektóre metody – na przykład „pistolet genowy” – polegają na projekcji genów bezpośrednio przez membranę do cytoplazmy. Stąd, geny mogą migrować do jądra.

Dodatkowo, istnieją techniki hybrydowe, które wykorzystują możliwości mechanicznych i chemicznych metod transfekcji. Na przykład, w ciągu ostatniej dekady pojawiło się wiele artykułów na temat magnetofekcji, metodologii transfekcji, która łączy transfekcję chemiczną z metodami mechanicznymi. Na przykład, lipidy kationowe mogą być stosowane w połączeniu z pistoletami genowymi lub elektroporatorami. Większość literatury na temat magnetofekcji dotyczy dostarczania genów i cząsteczek terapeutycznych do żywych organizmów.

Elektroporacja ma kilka zalet: wszechstronność (działa z każdym typem komórek), wydajność, bardzo niskie wymagania DNA i zdolność do działania w żywych organizmach. Wady obejmują potencjalne uszkodzenia komórek i niespecyficzny transport cząsteczek do i z komórki.

Ale wśród chemicznych, mechanicznych i wirusowych metod transfekcji, sama elektroporacja daje rozsądną pewność sukcesu, niezależnie od komórki docelowej lub organizmu.

Na przykład, transformacja chemiczna i elektroporacja to dwie wiodące metody wprowadzania DNA do Escherichia coli. W przypadku tej ostatniej, bakterie muszą najpierw stać się „kompetentne” poprzez usunięcie soli buforowych, aby zapewnić, że prąd dotrze do komórek, a następnie zastosowanie impulsu elektrycznego w temperaturze 0°C, aby ograniczyć uszkodzenia mikroorganizmów. Transformacja chemiczna obejmuje zawiesinę w CaCl2, która tworzy pory, a następnie szok cieplny, który powoduje wnikanie DNA do komórek.

Inne podejście wykorzystuje lipidy kationowe do otwierania błon komórkowych. Elektroporacja jest mniej kłopotliwa i bardziej wydajna, działa na bardziej zróżnicowane typy komórek i łatwiej poddaje się standardowym metodom niż chemiczna transfekcja. Niektórzy badacze wolą jednak transformację chemiczną, ponieważ nie wymaga ona zakupu instrumentu.

Umożliwienie innowacji

Ale po raz pierwszy opisana w 1965 roku, elektroporacja nadal otwiera drogi do innowacyjnej nauki w zakresie oprzyrządowania, protokołów i eksperymentów. Co najmniej kilkanaście grup uniwersyteckich opracowało urządzenia do elektroporacji oparte na systemach mikroelektromechanicznych (MEMS). Jedn± z zalet urz±dzeń mikrokanałowych jest to, że można je zaprojektować tak, aby nie przykładać do nich większego napięcia niż to, które jest wystarczaj±ce do uzyskania rozs±dnej inkorporacji makromolekuł. Ta zaleta ma również wadę. W przeciwieństwie do komercyjnych systemów elektroporacji, chipy nie działają ze wszystkimi komórkami.

Grupa z Wydziału Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Louisiana Tech pod kierownictwem dr Shengnian Wang odkryła, że nanocząstki złota zwiększają wydajność komercyjnych urządzeń do elektroporacji.1 Wang uważa, że cząstki, które są wysoce przewodzące, zmniejszają przewodnictwo medium komórkowego, działając jednocześnie jako „wirtualne mikroelektrody”, które pomagają otwierać błony fosfolipidowe. Twierdzi on, że dzięki niższym napięciom porcjonowania zwiększa się wydajność (lepsza skuteczność dostarczania DNA) i żywotność komórek.

Badacze z Charité Universitätsmedizin Berlin2 opracowali strategię łączonej elektroporacji z kwadratowymi impulsami w celu powtarzalnej transfekcji komórek. Mgr Britta Siegmund i współpracownicy zawieszają komórki w buforze i poddają je początkowemu impulsowi wysokiego napięcia, po którym następuje impuls niskiego napięcia o różnej wartości elektrycznej i czasowej. Dr Siegmund twierdzi, że przeżywalność jest porównywalna do standardowej elektroporacji, a skuteczność transfekcji sięga 95%. Podsumowuje, że technika ta może być „łatwo przystosowana do komórek uważanych za trudne do transfekcji.”

Oprócz powszechnego transferu DNA, transfekcja została zastosowana do wprowadzania interferującego RNA do różnych typów komórek. Technika ta pozwala na kontrolowane, prowadzone na małą skalę badania skuteczności dozowania i dostarczania. Problemy z dawkowaniem i dostarczaniem nękały praktyczne zastosowania interferencji RNA w terapii. Jednak przynajmniej jedno badanie poddało w wątpliwość, czy geny interferencji RNA są najskuteczniej wprowadzane do komórek pierwotnych za pomocą odczynników do transfekcji czy elektroporacji.3

Kirsty Jensen, Ph.D., i współpracownicy z University of Edinburgh porównali skuteczność 11 zestawów odczynników do transfekcji przejściowej i elektroporacji w wyciszaniu immunomodulującego genu gorączki śródziemnomorskiej (MEFV) w makrofagach pochodzących z monocytów bydła. Grupa testowała metodologie wychwytu małego interferującego RNA, knockdownu genów docelowych, toksyczności komórek i indukcji odpowiedzi interferonu typu I.

Elektroporacja była w przybliżeniu tak samo skuteczna w wyciszaniu MEFV jak odczynniki do transfekcji. W przeciwieństwie do odczynników, elektroporacja nie wywołała odpowiedzi interferonowej, ale żywotność komórek była niższa. Kwestie żywotności i efektywności transfekcji w przypadku elektroporacji są zazwyczaj traktowane jako ocena techniki.

Dr Jensen stwierdził, że „użycie odczynników do transfekcji jest bardziej odpowiednie niż elektroporacja dla naszej pracy badającej rolę genów makrofagów gospodarza w odpowiedzi na infekcję”, ale „wybór transfekcji lub elektroporacji małego interferującego RNA do komórek zależy od poszczególnych eksperymentów.”

W co najmniej kilku przypadkach, w których wyniki elektroporacji są suboptymalne, badacze zaniedbali optymalizację warunków innych niż siła impulsu elektrycznego. Jak ostatnio zauważyli Hu i współpracownicy,4 na skuteczność elektroporacji mają wpływ czynniki nieelektryczne, takie jak typ komórki lub tkanki oraz skład DNA.

Elektroporacja stała się niezbędną metodą zarówno w biologii rozwojowej in vitro, jak i in vivo. Znaczna część tej pracy odbywa się w pojedynczych komórkach, przyczyniając się do powstania modelu cieszącego się dużym zainteresowaniem w terapiach, diagnostyce, dostarczaniu leków i biologii komórki. Bezpośrednia nanoporacja pojedynczych komórek jest trudna ze względu na niepewność związaną z żywotnością po porcjowaniu.

Badacze z Northwestern University opracowali technikę dla pojedynczych komórek, która zapewnia wysoką żywotność i wydajność.5 Ich podejście wykorzystuje mikrofabrykowane urządzenie wysięgnikowe, sondę nanofontannową (NFP). Dostarcza ono cząsteczki do komórek w sposób bardziej delikatny niż mikroiniekcja lub nanoporacja. Badacze zademonstrowali elektroporację pojedynczych komórek HeLa za pomocą NFP z wydajnością transfekcji lepszą niż 95%, żywotnością 92% i jakościową kontrolą dawki.

NFP stanowią ulepszenie w stosunku do starszych technologii transfekcji wykorzystujących sondy mikroskopu sił atomowych. Techniki oparte na mikroskopii sił atomowych często powodują utratę przyczepności komórek lub ich rozerwanie. NFP powoduje mniejsze uszkodzenia komórek.