Dephosphorylation

V.B Protein Phosphatases in RPTK Signaling

Dephosphorylation tyrosine is another fast-acting mechanism for the inhibition or termination of signaling from RPTKs. Fosforylacja białek w transdukcji sygnału jest odwracalna, a PTK działają w porozumieniu z PTPazami w określaniu inicjacji, zakresu i zakończenia fosforylacji tyrozyny. Downregulacja sygnalizacji RPTK zachodzi nie tylko poprzez bezpośrednią fosforylację fosfotyrozyny samego RPTK (tj. RPTK jest substratem dla PTPazy), ale również poprzez deposforylację kluczowego celu downstream RPTK. Ponieważ białka fosforylowane tyrozyną, białka fosforylowane seryną i treoniną, a nawet fosfolipidy są mediatorami sygnalizacji RPTK, istnieją przykłady fosfataz białkowych specyficznych dla seryny/treoniny oraz fosfataz lipidowych specyficznych dla fosfoinozytydu, które również pośredniczą w wyciszaniu sygnalizacji inicjowanej przez RPTK. Kilka przykładów poniżej, jak również krótki, ogólny opis fosfataz białkowych.

Wszystkie zidentyfikowane PTPazy zawierają konserwowaną, ∼280 aminokwasową domenę PTPazy. Ich specyficzna aktywność katalityczna jest około 1000-krotnie wyższa i znacznie mniej specyficzna niż PTK. Podobnie jak w przypadku PTK, PTPazy można podzielić na PTPazy transmembranowe i cytoplazmatyczne. Transbłonowe PTPazy zawierają zewnątrzkomórkowe regiony z motywami takimi jak powtórzenia fibronektyny typu III, powtórzenia kadherynopodobne i domeny immunoglobulinopodobne. Posiadają one pojedynczy region transmembranowy, po którym zwykle następują dwie domeny PTPazy, z których tylko jedna wydaje się przyczyniać do aktywności katalitycznej. Jak wskazywałby ich region zewnątrzkomórkowy, niektóre transmembranowe PTPazy, takie jak PTPκ i PTPμ, biorą udział w homofilnej adhezji komórka-komórka, a PTPμ może stabilizować kontakty komórka-komórka poprzez deposforylację katenin i kadheryn. Te i inne transmembranowe PTPazy nie zostały zaangażowane w bezpośrednią dephosforylację RPTK, w przeciwieństwie do cytoplazmatycznych PTPaz, z których kilka jest zdolnych do bezpośredniej dephosforylacji RPTK.

Cytoplazmatyczna cytoplazmatyczna białkowa fosfataza tyrozynowa SHP-1 jest jedną z zaledwie dwóch zidentyfikowanych PTPaz zawierających domenę SH2. SHP-1 wiąże się z aktywowanymi RPTK, takimi jak CSF-1 i receptor Kit/SCF, poprzez jedną ze swoich dwóch domen SH2. Wiązanie SH2 SHP-1 i strukturalnie pokrewnej SHP-2 (patrz dalej), zwalnia autoinhibicyjne ograniczenie na domenę PTPazy. W związku z tym wykazano, że zarówno receptory CSF-1, jak i Kit/SCF są bezpośrednimi substratami dla SHP-1 i że SHP-1 jest ważny dla normalnej regulacji sygnalizacji receptorów Kit i CSF-1. Ma to również znaczenie fizjologiczne. Stąd u myszy z fenotypem motheaten (me), który jest spowodowany naturalnie występującymi mutacjami typu LOF (loss-of-function) w SHP-1, występują liczne nieprawidłowości hematopoetyczne spowodowane hiperproliferacją komórek mieloidalnych/monocytarnych i komórek tucznych. Uważa się, że rozregulowana sygnalizacja receptorów CSF-1 i Kit jest przyczyną tych defektów, co potwierdzają badania pokazujące, że fenotyp dominujących myszy z mutacją White-spotting (W), które mają naturalnie występujące mutacje LOF w Kit, jest łagodzony przez krzyżowanie z myszami z mutacją me i vice versa. Te i nowsze dane pokazujące alternatywne transkrypty powodujące albo truncacje SHP-1 lub mutacje frameshift skutkujące utratą SHP-1 w pierwotnych liniach komórkowych nowotworów wykazujących ekspresję Kit, ustanowionych od pacjentów z białaczką, wskazują, że SHP-1 jest supresorem nowotworu.

Fosfataza białkowo-tyrozynowa PTP1B jest kolejną cytozolową fosfatazą, która jest zaangażowana w bezpośrednią regulację sygnalizacji RPTK. PTP1B wiąże się z aktywowanymi receptorami insuliny i IGF-1 poprzez swoją N-końcową domenę katalityczną w nieznanym mechanizmie. Po związaniu, PTP1B bezpośrednio deposforyluje sam receptor insulinowy i jego główne białko dokujące, substrat receptora insulinowego-1 (IRS-1). Odpowiednio, celowa delecja PTP1B u myszy powoduje hiperfosforylację receptora insulinowego i IRS-1 oraz uwrażliwienie sygnalizacji insulinowej. PTP1B deposforyluje również STAT5a i STAT5b, zapobiegając ich translokacji jądrowej i aktywności transkrypcyjnej. STAT5a i STAT5b są fosforylowane przez JAK aktywowane przez receptory cytokinowe, ale są również fosforylowane bezpośrednio przez kilka RPTK.

Jednakże PTP1B, jak również receptoropodobna PTPα i SHP-2, inna fosfataza zawierająca domenę SH2, zostały również zaangażowane we wzmocnienie sygnalizacji downstream RPTK. PTP1B ulega nadekspresji w liniach komórkowych raka piersi, gdzie powoduje dephosforylację Tyr 527 na C-końcu c-Src. Prowadzi to do zwiększenia aktywności kinazy Src, ponieważ fosforylacja tego miejsca hamuje aktywność Src poprzez allosteryczny, autoinhibicyjny mechanizm. Transbłonowy RPTPα jest fosforylowany tyrozynowo in vivo na Tyr789, co tworzy miejsce wi±zania dla c-Src, umożliwiaj±c RPTPα dephosforylację Tyr527 w Src in vitro. Co ciekawe, zarówno wiązanie, jak i dephosforylacja Src zależą od fosforylacji przy Tyr789, a mechanizm przemieszczenia fosfotyrozyny został zaproponowany dla aktywacji Src przez RPTPα. Zgodnie z tym, mutanty RPTPα pozbawione kinazy lub mutanty Tyr789Phe znoszą transformację nowotworową przez nadekspresję RPTPα, a ukierunkowane przerwanie RPTPα powoduje zmniejszenie aktywności członków rodziny Src w komórkach pochodzących od zmutowanych myszy, co koreluje ze zwiększonym poziomem fosforylacji Tyr 527. SHP-2, który ulega wszechobecnej ekspresji, łączy się in vivo poprzez swoje domeny SH2 z licznymi RPTK i substratami PTK, w tym z receptorami dla PDGF, EGF, insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 (IGF-1) i SCF, a także z białkiem dokowania IRS-1. SHP-2 ulega fosforylacji tyrozynowej w odpowiedzi na stymulację kilkoma czynnikami wzrostu, a ufosforylowany tyrozynowo SHP-2 wiąże się z receptorami dla PDGF lub SCF, jak również z cząsteczką adaptorową Grb2. Z kolei wykazano, że związany SHP-2 selektywnie deposforyluje reszty tyrozynowe w PDGFR-β, ważne dla wiązania PI 3′-kinazy i GAP dla Ras. Ponadto, mikroiniekcja przeciwciał blokujących SHP-2, ekspresja domen SH2 SHP-2 lub katalitycznie nieaktywnego SHP-2 hamuje mitogenezę stymulowaną przez EGF, insulinę i IGF-1. Wyniki te sugeruj±, że SHP-2 jest aktywatorem szlaku sygnałowego Ras i innych szlaków sygnałowych regulowanych przez Grb2 i prawdopodobnie jest modulatorem sygnalizacji PI 3′-kinazy indukowanej przez RPTK. Podobnie jak w przypadku SHP-1, wiązanie SHP-2 może aktywować jego funkcję katalityczną. Twierdzi się również, że SHP-2 dephosphorylate Tyr527 w C terminusie Src, co zapewnia dodatkową pozytywną regulację sygnalizacji.

Several protein serine/threonine kinases and substrates thereof are dephosphorylated by the major serine/threonine-specific phosphatase PP2A. Jest to cytoplazmatyczna i jądrowa heterotrimeryczna fosfataza, składająca się ze strukturalnej podjednostki A. regulacyjnej podjednostki B i katalitycznej podjednostki C. PP2A wiąże się z licznymi białkami rusztowania poprzez swoją podjednostkę regulacyjną, a jej aktywność jest ściśle regulowana w kontekście zmontowanych rusztowań. Jednym z ważnych substratów w sygnalizacji RPTK jest docelowy PI 3′-kinaza Akt, białkowa kinaza serynowo-treoninowa pośrednicząca w przeżyciu komórek częściowo poprzez fosforylację członka rodziny Bcl-2 – Bad. PP2A deposforyluje aktywujące miejsce fosforylacji T308 w Akt, kluczowe dla aktywności kinazy. Ponadto, PP2A może fosforylować antyapoptotyczną cząsteczkę Bcl-2, znosząc jej funkcję przeżycia. Zidentyfikowano wiele innych substratów dla PP2A, z których wiele jest ważnymi celami RPTK.

Dwie fosfatazy specyficzne dla fosfoinozytydów, PTEN i SHIP1/2, odpowiednio, specyficznie deposforylują pozycję D-3 i D-5 pierścienia inozytolowego w PtdIns(3,4,5)P3, jednym z głównych efektorów sygnalizacji PI 3′-kinazy. Przeciwdziała to sygnalizacji PI 3′-kinazy inicjowanej przez RPTK, w związku z czym PTEN okazał się być często mutowanym ludzkim genem supresorowym nowotworów. Inaktywujące mutacje w PTEN są instrumentalne w niektórych nowotworach neuronalnych, piersi i komórek płciowych u ludzi, co jest związane ze zwiększoną aktywnością Akt.

.