Clinical Significance of Cannabinoid Receptors CB1 and CB2 Expression in Human Malignant and Benign Thyroid Lesions
Abstract
Układ endokannabinoidowy składa się z receptorów kannabinoidowych (CB1 i CB2), Ich endogenne ligandy (endokannabinoidy) oraz białka odpowiedzialne za ich metabolizm biorą udział w wielu różnych funkcjach niezbędnych do regulacji homeostazy w wielu tkankach, wywierając również działanie przeciwnowotworowe. Celem pracy była ocena znaczenia klinicznego ekspresji białek CB1 i CB2 w łagodnych i złośliwych zmianach tarczycy u ludzi. Ekspresję białek CB1 i CB2 oceniano immunohistochemicznie w zatopionych w parafinie tkankach tarczycy pobranych od 87 pacjentów ze zmianami łagodnymi i złośliwymi i analizowano statystycznie z parametrami klinopatologicznymi, zdolnością proliferacyjną komórek pęcherzykowych oraz ryzykiem nawrotu choroby ocenianym według systemu staging Amerykańskiego Towarzystwa Tarczycowego (American Thyroid Association – ATA). Zwiększona ekspresja CB1 i CB2 była istotnie częściej obserwowana w złośliwych zmianach tarczycy w porównaniu z łagodnymi ( i , resp.). Zwiększona ekspresja CB1 i CB2 była również istotnie częściej obserwowana w rakach brodawkowatych w porównaniu z guzkami hiperplastycznymi ( i , resp.). W złośliwych zmianach tarczycy podwyższona ekspresja CB2 była istotnie związana z obecnością przerzutów do węzłów chłonnych. Zwiększona ekspresja CB2 była również częściej obserwowana w złośliwych tarczycy z obecnością inwazji kapsularnej, limfatycznej i naczyniowej, a także w tych z podwyższonym ryzykiem nawrotu, na poziomie nieistotnym, podczas gdy ekspresja CB1 nie była związana z żadnym z badanych parametrów klinopatologicznych. Nasze dane sugerują, że receptory CB mogą być zaangażowane w transformację złośliwą tarczycy, a szczególnie receptor CB2 może służyć jako użyteczny biomarker i potencjalny cel terapeutyczny w neoplazji tarczycy.
1. Wprowadzenie
Układ endokannabinoidowy (ECS) jest endogennym lipidowym układem indukującym sygnały, obecnym w różnych tkankach człowieka, który pełni wiele różnych i niepowiązanych ze sobą funkcji. Znaczące badania wykazały regulacyjne działanie ECS na ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy, przewód pokarmowy i układ odpornościowy, będąc zaangażowanym w wiele procesów, takich jak motoryka przewodu pokarmowego, nastrój, regulacja bólu, pamięć i apetyt. Funkcje te są wywoływane przez wiązanie endogennych i egzogennych ligandów z receptorami kannabinoidowymi (receptory CB). Poza tymi dobrze znanymi funkcjami, ECS wywiera również działanie antyproliferacyjne poprzez modulację kilku szlaków sygnałowych, a jego aktywacja może mieć znaczenie prognostyczne dla progresji rozwoju nowotworu .
Istnieją dwa podtypy receptorów CB, różniące się rozmieszczeniem w ludzkich tkankach. Receptor CB1 jest głównie zlokalizowany w ośrodkowym układzie nerwowym, adipocytach, wątrobie, trzustce, mięśniach szkieletowych i limfocytach T. Receptor CB2 jest wykrywany głównie w komórkach układu odpornościowego, ale także w neuronach i innych komórkach ośrodkowego układu nerwowego, takich jak astrocyty i mikroglej, a także w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych. Aktywacja receptorów CB hamuje powstawanie cAMP poprzez jego sprzężenie z białkami Gi, co prowadzi do zmniejszenia fosforylacji zależnej od kinazy białkowej A (PKA). Receptory CB sprzęgają się również z kinazą regulowaną sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK), a w szczególności z p42/p44 i p38, uczestnicząc w sygnalizacji fosfatydyloinozytolu 3-kinazy (PI3K) i ceramidu. Do ECS przyłączone są również inne receptory, takie jak kanały kationowe potencjału receptorów przejściowych podrodziny V członek 1 (TRPV-1), receptory aktywowane proliferatorami peroksysomów (PPAR) oraz receptory sprzężone z białkami GPR55 niebędące receptorami CB1/CB2 .
Ligandami ECS są kannabinoidy, w tym bioaktywne składniki Cannabis Sativa, syntetyczne związki CB-mimetyczne oraz endogenne ligandy receptorów CB . Najważniejszą cząsteczką z pierwszej kategorii jest Δ9-THC, która jest dobrze znana ze swoich cech psychoaktywnych. Pozostałe dwie kategorie obejmują syntetyczne ligandy, które są obecnie opracowywane (CP55940, HU-210, HU-211, ab-kannabidiol, kwas ajulemowy, WIN55,212-2) oraz endokannabinoidy, które są produkowane przez organizm ludzki i są lipidowymi pochodnymi kwasu arachidonowego (AA) sprzężonymi z etanoloaminą lub glicerolem. Najważniejsze z tych cząsteczek to anandamid (AEA) i 2-arachidonoiloglicerol (2-AG), ale zidentyfikowano również inne substancje, takie jak O-arachidonoyloetanolamina (OAE, wirodamina), eter 2-arachidonoiloglicerolu (2-AGE, eter noladyny), N-arachidonoyldopamina (NADA) i palmitoolethanolamid (PEA). Oprócz receptorów CB i wszystkich ich ligandów, ECS obejmuje również enzymy niezbędne do biosyntezy, transportu i degradacji ligandów .
Oprócz funkcji ECS w celu utrzymania homeostazy, wspomniany wyżej cross-talk między ECS a najważniejszymi szlakami onkogennymi (szlak MAPK/ERK i PI3K/Akt) zyskał ostatnio zainteresowanie i podkreślił znaczenie ECS w nowotworzeniu . Ponadto wykazano, że kannabinoidy indukują apoptozę w komórkach nowotworowych, hamują unaczynienie guza poprzez zmniejszenie VEGF i hamują zdolność inwazyjną komórek nowotworowych. Efekty antyproliferacyjne przeważają i kilka badań sugeruje, że kannabinoidy mają potencjał jako środki przeciwnowotworowe .
Diagnozowanie zmian w tarczycy zostało ostatnio zwiększone, nie tylko ze względu na ulepszone techniki diagnostyczne, ale także z powodu ich prawdziwego wzrostu częstości występowania w populacji. W rzeczywistości, rak tarczycy jest najczęstszym nowotworem złośliwym układu wewnątrzwydzielniczego. Chociaż rak tarczycy jest zwykle całkowicie wyleczony przez operację i terapię, 10-20% pacjentów nadal umiera z powodu nawrotu lub progresji nowotworu. Dlatego tak ważne jest opracowanie nowych strategii leczenia i znalezienie nowych markerów prognostycznych, które pozwolą przewidzieć przebieg kliniczny u każdego pacjenta i odpowiednio dostosować dostępne metody terapeutyczne. W tym aspekcie, niniejsze badanie miało na celu ocenę immunohistochemicznej ekspresji receptorów CB1 i CB2 w łagodnych i złośliwych zmianach tarczycy w powiązaniu z cechami kliniczno-patologicznymi związanymi z rokowaniem.
2. Pacjenci i metody
2.1. Pacjenci
Badany materiał stanowiło 87 wycinków histologicznych tarczycy pochodzących od równej liczby pacjentów, u których wykonano operacje tarczycy z powodu zmian łagodnych i złośliwych. Badaniami objęto 43 przypadki łagodne (37 guzków hiperplastycznych i 6 zapaleń tarczycy typu Hashimoto) i 44 przypadki złośliwe (40 raków brodawkowatych i 4 raki pęcherzykowe). Każdy z nowotworów został sklasyfikowany zgodnie z klasyfikacją histologiczną WHO. Ryzyko nawrotu choroby oceniano według systemu stagingowego Amerykańskiego Towarzystwa Tarczycowego (ATA). Żaden z pacjentów nie otrzymał żadnego rodzaju leczenia przeciwnowotworowego przed operacją i nie było historii klinicznej napromieniania głowy i szyi lub innych nowotworów.
2.2. Immunohistochemia
Immunostaining for CB1 and CB2 were performed on formalin-fixed, paraffin-embedded thyroid tissue sections using a goat polyclonal CB1 IgG antibody (N-15, sc-10066, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) and a rabbit polyclonal CB2 IgG antibody (H-60, sc-25494, Santa Cruz Biotechnology). W skrócie, fragmenty tkanki o grubości 4 μm odparafinowano w ksylenie i doprowadzono do wody za pomocą stopniowanych alkoholi. Retrieval antygenów przeprowadzono przez mikrofalowanie szkiełek w 10 mM buforze cytrynianowym (pH 6,1) przez 15 minut (min) przy wysokiej mocy, zgodnie z instrukcjami producenta. Aby usunąć aktywność endogennej peroksydazy, sekcje były następnie traktowane świeżo przygotowanym 0,3% nadtlenkiem wodoru w metanolu w ciemności, przez 30 min, w temperaturze pokojowej. Nieswoiste wiązanie przeciwciał blokowano za pomocą Eraser i Sniper, specyficznych odczynników blokujących odpowiednio dla kozich i króliczych przeciwciał pierwszorzędowych (Biocare Medical, Concord, California, USA), przez 5 min. Sekcje inkubowano przez 1 godzinę (h), w temperaturze pokojowej, z przeciwciałami pierwotnymi przeciwko CB1 i CB2 rozcieńczonymi odpowiednio 1 : 300 i 1 : 200 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie sekcje inkubowano w temperaturze pokojowej z biotynylowanym odczynnikiem łączącym (Biocare Medical) przez 10 min, a następnie inkubowano z etykietą peroksydazy sprzężonej ze streptawidyną (Biocare Medical) przez 10 min. Powstałą w ten sposób immunologiczną aktywność peroksydazy wywoływano przy użyciu zestawu substratów DAB (Vector Laboratories, Kalifornia, USA) przez 10 min. Sekcje były barwione hematoksyliną Harrisa i utrwalane w Entellanie (Merck, Darmstadt, Niemcy). Odpowiednie kontrole negatywne przeprowadzono przez pominięcie przeciwciała pierwotnego i/lub zastąpienie go nieistotną surowicą. Jako kontrolę pozytywną zastosowano wycinki tkanek raka płaskonabłonkowego piersi i języka komórkowego o znanej ekspresji CB1 i CB2. Zdolność proliferacyjną komórek pęcherzykowych oceniano na podstawie ekspresji immunohistochemicznej Ki-67, jak wcześniej opisano .
2.3. Ocena immunohistochemii
Ocena immunohistochemiczna została przeprowadzona przez liczenie co najmniej 1000 komórek nowotworowych w każdym przypadku przez dwóch niezależnych obserwatorów (Stamatios Theocharis i Paraskevi Alexandrou) zaślepionych na dane kliniczne, z pełną zgodą obserwatorów. Okazy zostały uznane za „pozytywne” dla CB1 i CB2, gdy więcej niż 5% komórek nowotworowych w sekcji było pozytywnie wybarwionych. Immunoreaktywność komórek guza dla CB1 i CB2 była oceniana zgodnie z odsetkiem komórek guza CB1 i CB2 pozytywnych jako 0: negatywne barwienie – 0-4% komórek guza pozytywnych; 1: 5-24% komórek guza pozytywnych; 2: 25-49% komórek guza pozytywnych; 3: 50-100% komórek guza pozytywnych i jego intensywność jako 0: negatywne barwienie, 1: łagodne barwienie; 2: pośrednie barwienie; 3: intensywne barwienie. Wreszcie, ekspresja CB1 i CB2 została sklasyfikowana jako niska, jeśli całkowity wynik wynosił 0 lub 2 i wysoka, jeśli całkowity wynik wynosił ≥3. Immunoreaktywność Ki-67 sklasyfikowano na podstawie odsetka pozytywnie wybarwionych komórek pęcherzykowych, które przekroczyły medianę wartości procentowej w dwóch kategoriach (poniżej i powyżej wartości średniej), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami .
2.4. Analiza statystyczna
Testy chi kwadrat zastosowano do oceny różnicy ekspresji CB1 i CB2 między złośliwymi i łagodnymi zmianami tarczycy, a także między przypadkami raka brodawkowatego i guzkami hiperplastycznymi. Testy chi kwadrat zastosowano do oceny związku między ekspresją CB1 i CB2 a cechami kliniczno-patologicznymi w podgrupie pacjentów ze złośliwymi zmianami tarczycy. Za znamienną statystycznie uznawano wartość 2-krotnie większą. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu pakietu oprogramowania SPSS for Windows (wersja 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
3. Wyniki
3.1. Clinical Significance of CB1 Expression in Human Malignant and Benign Thyroid Lesions
Pozytywną ekspresję CB1 (IHC score > 0) stwierdzono w 52 (60%) z 87 zmian tarczycy. Trzydzieści jeden (36%) z 87 badanych przypadków prezentowało wysoką immunoreaktywność CB1 (IHC score ≥ 3). Subkomórkowy wzór dystrybucji CB1 był przeważnie cytoplazmatyczny i sporadycznie błoniasty. Normalne obszary przylegające do guza okazały się negatywne dla CB1. Reprezentatywne barwienia CB1 dla guzka hiperplastycznego i raka brodawkowatego przedstawiono odpowiednio na rycinach 1(a) i 1(b). Immunoreaktywność CB1 różniła się istotnie pomiędzy łagodnymi i złośliwymi zmianami tarczycy (Tabela 1, ). Wysoka ekspresja CB1 była istotnie częściej obserwowana w raku brodawkowatym w porównaniu z guzkami hiperplastycznymi (tab. 1, ). Ekspresja CB1 nie była związana z wiekiem i płcią pacjentów oraz zdolnością proliferacyjną komórek pęcherzykowych. W podgrupie zmian złośliwych tarczycy wysoką ekspresję CB1 stwierdzono w 23 (52%) z 44 przypadków. Nie stwierdzono związku pomiędzy ekspresją receptorów CB1 a wielkością guza, obecnością inwazji kapsularnej, naczyniowej lub limfatycznej, przerzutami do węzłów chłonnych oraz wskaźnikiem proliferacji komórek pęcherzykowych (tab. 2). Ekspresja receptora CB1 nie była związana z ryzykiem nawrotu choroby ocenianym według systemu staging ATA (dane niepokazane).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. Clinical Significance of CB2 Expression in Human Malignant and Benign Thyroid Lesions
Pozytywność CB2 (IHC score > 0) stwierdzono w 61 (71%) z 87 zmian tarczycy. Trzydzieści dwa (37%) z 87 badanych przypadków prezentowało wysoką immunoreaktywność CB2 (IHC score ≥ 3). Subkomórkowy wzór dystrybucji był przeważnie cytoplazmatyczny i sporadycznie błoniasty. Prawidłowe obszary przylegające do guza nie wykazywały obecności CB2. Reprezentatywne barwienia CB2 dla guzków hiperplastycznych i raka brodawkowatego przedstawiono odpowiednio na rycinach 1(c) i 1(d). Wysoka ekspresja CB2 była istotnie częściej obserwowana w złośliwych zmianach tarczycy w porównaniu z łagodnymi, a także w raku brodawkowatym w porównaniu z guzkami hiperplastycznymi (Tabela 1, i , odpowiednio). W podgrupie zmian złośliwych tarczycy wysoką ekspresję CB2 stwierdzono w 24 (55%) z 44 przypadków. Wysoka ekspresja CB2 była istotnie związana z obecnością przerzutów do węzłów chłonnych (tab. 2, ). Wysoka ekspresja CB2 była również związana z obecnością kapsulacji, inwazji limfatycznej i inwazji naczyniowej, jednak na poziomie nieistotnym (Tabela 2, , , i , odpowiednio). Nie stwierdzono związku pomiędzy ekspresją CB2 a wiekiem i płcią pacjentów, wielkością guza i wskaźnikiem proliferacji komórek pęcherzykowych (Tabela 2). Wysoka ekspresja receptora CB2 była częściej obserwowana w złośliwych zmianach tarczycy prezentujących zwiększone ryzyko nawrotu według systemu staging ATA, na poziomie nieistotnym, choć ().
4. Dyskusja
W prezentowanym badaniu ekspresja białek CB1 i CB2 była zwiększona w złośliwych w porównaniu z łagodnymi zmianami tarczycy. Po raz pierwszy opisano również związek pomiędzy ekspresją białka CB2 a parametrami kliniczno-patologicznymi, które mają kluczowe znaczenie dla rokowania pacjentów. W szczególności, zwiększona ekspresja CB2 była istotnie związana z obecnością przerzutów do węzłów chłonnych i granicznie z obecnością inwazji naczyniowej, podczas gdy odnotowano również orientacyjne, ale nieistotne związki z obecnością inwazji kapsularnej i limfatycznej oraz szacowaną częstością nawrotów. Podobne wyniki nadekspresji receptorów CB1 uzyskano w przypadku złośliwych zmian tarczycy w porównaniu z łagodnymi, niemniej jednak odnotowano nieistotny związek lub trend korelacji pomiędzy ekspresją CB1 a parametrami klinopatologicznymi.
Zgodnie z obecnymi ustaleniami, receptory CB1 były podwyższone w niektórych nowotworowych ludzkich nowotworach złośliwych, w tym w raku płaskonabłonkowym jamy ustnej, raku trzustki, raku wątrobowokomórkowym i raku gruczołu krokowego, podczas gdy nie ulegały ekspresji w prawidłowych tkankach tych narządów. Z drugiej strony, receptor CB1 był obniżony w raku jelita grubego w przeciwieństwie do sąsiednich normalnych tkanek, wskazując na różne role ECS w różnych nowotworach i wskazując na liczne interakcje między ECS a mechanizmami kontrolującymi wzrost i proliferację komórek. Mechanizmy te mogą obejmować bezpośrednią indukcję śmierci komórek transformowanych, zatrzymanie cyklu komórkowego oraz hamowanie angiogenezy i przerzutów nowotworowych. Przeciwnowotworowe działanie ECS zostało również przedstawione w licznych badaniach. W raku jelita grubego endokannabinoidy i syntetyczne kannabinoidy były w stanie indukować apoptozę i hamować kancerogenezę poprzez mechanizmy angażujące zarówno receptory CB, kanały TRPV1, jak i szlak PPARγ. Podobne wyniki uzyskano w badaniach prowadzonych na raku trzustki, płuc, piersi, cholangiocarcinoma i raku wątrobowokomórkowym. Odnotowano również synergistyczne działanie kannabinoidów z konwencjonalną chemioterapią przeciwnowotworową .
Nadekspresja receptora CB w raku tarczycy została ostatnio odnotowana, in vitro . Co więcej, stymulacja IL-12 linii komórkowych raka anaplastycznego tarczycy wywołała nadekspresję receptora CB2 i doprowadziła do apoptozy i regresji guza pod wpływem CB2-agonisty. Co więcej, nadekspresja CB2 sprawiła, że komórki nowotworowe stały się bardziej podatne na leczenie standardową chemioterapią. Jednym z domniemanych wyjaśnień tego zjawiska była zależna od ceramidu aktywacja wewnątrz mitochondrialnego szlaku, który prowadzi do apoptozy, wywołanej przez aktywację receptora CB2. W innym badaniu na liniach komórkowych raka tarczycy wykazano, że 2-metylo-2′-F-anandamid (Met-F-AEA) hamował wzrost guza, co było związane z wysokim poziomem receptorów CB1. Obfita ekspresja receptora CB1 została odnotowana w liniach komórkowych bardziej wrażliwych na leczenie, które następnie były bardziej podatne na hamowanie wzrostu. Takie wyniki przypisano aktywacji p53, wzrostowi i obniżeniu cykliny A, co prowadziło do apoptozy .
Oprócz możliwych implikacji terapeutycznych dotyczących tumorigenesis i ECS, wykrywanie nadekspresji receptorów CB może mieć potencjał jako wskaźniki prognostyczne. Upregulation of both CB receptors in hepatocellular carcinoma tissue samples was significantly associated with improved prognosis and longer disease-free survival . Wyniki te były połączone z charakterystyką histopatologiczną guza, ponieważ wysoki poziom receptorów CB obserwowano w przypadkach dobrze zróżnicowanych i z ograniczonym zajęciem przewodu wrotnego. Z drugiej strony, immunoreaktywność CB2 była związana z krótszym czasem przeżycia wolnego od choroby w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi. Jeśli chodzi o receptor CB1, jego nadekspresja wiązała się z gorszym wynikiem leczenia w raku jelita grubego, prostaty i trzustki. W szczególności, zwiększona ekspresja CB1 u pacjentów z IV stadium raka jelita grubego była niezależnie skorelowana ze złym rokowaniem. Zwiększona ekspresja CB1 była również związana z agresywnym gruczolakorakiem prostaty, charakteryzującym się wyższą punktacją w skali Gleasona, większym rozmiarem guza i zwiększonym wskaźnikiem proliferacji komórek, a także przerzutami w momencie rozpoznania. Ponadto, niska ekspresja CB1 lub wysoki poziom FAAH/MAGL były skorelowane z dłuższym czasem przeżycia i wyższym poziomem bólu. Podobne, ale nieistotne statystycznie wyniki odnotowano dla receptora CB2. Biorąc pod uwagę powyższe dane, obecnie dostępne badania dotyczące poziomu receptorów CB i ich związku z rokowaniem w różnych nowotworach wydają się sprzeczne i mogą być ściśle związane z zakresem udziału ECS w nowotworzeniu.
5. Wnioski
Wzmocnione poziomy ekspresji immunohistochemicznej receptorów CB1 i CB2 były skorelowane ze złośliwością gruczołu tarczowego. Co więcej, podwyższony poziom ekspresji CB2 był związany z cechami klinopatologicznymi istotnymi dla postępowania terapeutycznego u pacjentów. Wyniki te potwierdzają, że receptory CB, a szczególnie receptor CB2, mogą zakłócać szlaki molekularne uczestniczące w transformacji nowotworowej tarczycy i mogą być rozważane jako potencjalne cele terapeutyczne w celu zahamowania progresji nowotworu. Zalecane są większe badania kohortowe w celu potwierdzenia i ustalenia przydatności klinicznej receptorów CB jako potencjalnych markerów prognostycznych w nowotworach tarczycy.
Konflikt interesów
Wszyscy autorzy potwierdzają, że nie przyjęli żadnego finansowania ani wsparcia od organizacji, która może w jakikolwiek sposób zyskać lub stracić finansowo na wynikach niniejszego badania. Wszyscy autorzy potwierdzają, że nie byli zatrudnieni przez organizację, która może w jakikolwiek sposób zyskać lub stracić finansowo na wynikach niniejszego badania. Żaden z autorów nie ma innego konfliktu interesów.
Wkład autorów
Eleftheria Lakiotaki i Constantinos Giaginis w równym stopniu przyczynili się do powstania tego badania.
.
Leave a Reply