Chromatografia filtracyjna w żelu

Chromatografia filtracyjna w żelu Zastosowania

Chromatografia filtracyjna w żelu, rodzaj chromatografii wykluczania wielkości, może być stosowana do frakcjonowania cząsteczek i kompleksów w próbce na frakcje o określonym zakresie wielkości, do usuwania z próbki wszystkich cząsteczek większych niż określony rozmiar lub do kombinacji obu operacji. Chromatografia filtracji żelowej może być stosowana do rozdzielania związków takich jak małe cząsteczki, białka, kompleksy białkowe, polisacharydy i kwasy nukleinowe, gdy znajdują się w roztworze wodnym. Gdy rozpuszczalnik organiczny jest stosowany jako faza ruchoma, proces ten jest zamiast tego określany jako chromatografia żelowa permeacyjna.

Chromatografia żelowa filtracyjna może być również stosowana do:

• Frakcjonowania cząsteczek i kompleksów we wcześniej określonym zakresie wielkości
• Analizy i oznaczania wielkości
• Usuwania dużych białek i kompleksów
• Wymiany buforów
• Desaltingu
• Usuwania małych cząsteczek, takich jak nukleotydy, startery, barwniki, i zanieczyszczenia
• Ocena czystości próbki
• Oddzielanie związanych od niezwiązanych radioizotopów

Podłoża chromatograficzne do filtracji żelowej do wszystkich powyższych zastosowań są dostępne w postaci zapakowanych kolumn o przepływie grawitacyjnym, kolumn wirowych, niskociśnieniowych i średniociśnieniowych kolumn chromatograficznych oraz żywic w butelkach.

Mechanizm chromatografii filtracji żelowej

W kolumnie do chromatografii filtracji żelowej faza stacjonarna składa się z porowatej matrycy, a faza ruchoma jest buforem, który przepływa między kulkami matrycy. Kulki mają określony zakres wielkości porów, znany jako zakres frakcjonowania. Cząsteczki i kompleksy, które są zbyt duże, aby wejść w pory, pozostają w fazie ruchomej i przemieszczają się przez kolumnę wraz z przepływem buforu. Mniejsze cząsteczki i kompleksy, które są w stanie poruszać się w porach, wchodzą do fazy stacjonarnej i poruszają się przez kolumnę filtracji żelowej dłuższą drogą przez pory kulek.

Każda cząsteczka lub kompleks, który jest powyżej zakresu frakcjonowania dla danej kolumny chromatografii żelowej filtracji, będzie poruszać się przez kolumnę szybciej niż jakakolwiek cząsteczka, która może wejść do fazy stacjonarnej. Dlatego każdy składnik w próbce, który znajduje się powyżej zakresu frakcjonowania, będzie eluowany jako pierwszy (w objętości pustej) przed wszystkim, co znajduje się w zakresie frakcjonowania. Minimalny rozmiar, który pozostanie w fazie ruchomej i nie przedostanie się do fazy stacjonarnej jest znany jako granica wykluczenia. Firma Bio-Rad oferuje podłoża i kolumny do chromatografii żelowej z limitami wykluczenia w zakresie trzech rzędów wielkości, od 100 daltonów do 100 000 daltonów (100 kDa).

Molekuły i kompleksy, które mogą dostać się do fazy stacjonarnej będą frakcjonowane zgodnie z ich rozmiarami. Mniejsze cząsteczki będą migrować w głąb porów i będą bardziej opóźnione niż większe cząsteczki, które nie wchodzą tak łatwo w pory, a zatem są szybciej eluowane z kolumny. Ta różnica w migracji porów prowadzi do frakcjonowania składników według wielkości, przy czym największe cząsteczki są eluowane w pierwszej kolejności.

W kolumnach do chromatografii żelowej przeznaczonych do odsalania, wymiany buforów oraz usuwania małych cząsteczek, takich jak nukleotydy, sole i małe związki łatwo wchodzą w pory, są zatrzymywane i wolniej migrują przez kolumnę niż większe białka lub kwasy nukleinowe. Dlatego też interesujące składniki próbki są eluowane przed solami, nukleotydami itp. Zestawy do oczyszczania DNA wykorzystujące ten mechanizm często zawierają kolumny spinowe do filtracji żelowej.

Rozdzielczość, tutaj zdefiniowana jako ostrość granic pomiędzy frakcjami wielkości, jest określana przez wielkość kulek oraz szereg innych czynników. Mniejszy rozmiar perełek generalnie daje wyższą rozdzielczość w kolumnie chromatografii z filtracją żelową. Cząsteczki zwarte dyfundują przez fazę stacjonarną szybciej niż cząsteczki liniowe. Na wykluczenie rozmiaru, zakres frakcjonowania i szybkość elucji mają wpływ skład buforu, siła jonowa i pH. W przypadku frakcjonowania złożonych mieszanin białek, czasy elucji i granice wykluczenia rozmiaru mogą wymagać określenia empirycznego.

Podłoża do chromatografii filtracji żelowej

Ważnym kryterium dla podłoży do chromatografii filtracji żelowej jest to, że podłoże jest obojętne i że nic w próbce ani w żadnym buforze nie wiąże się z podłożem. Innym aspektem jest rodzaj stosowanej kolumny do filtracji żelowej oraz to, czy jest ona stosowana w ciśnieniowym systemie chromatograficznym, czy w kolumnach o przepływie grawitacyjnym lub wirowych. Jeżeli stosowany jest system chromatografii ciśnieniowej, zarówno kolumna, jak i nośnik muszą być w stanie tolerować stosowane ciśnienie i natężenie przepływu.

Powszechnie stosowane nośniki do chromatografii z filtracją żelową są oparte na kulkach agarozy lub poliakrylamidu, dekstrozy dla systemów grawitacyjnych lub niskociśnieniowych oraz żywicach polimerowych dla systemów średniociśnieniowych. Wybór mediów zależy od właściwości rozdzielanych składników i innych czynników doświadczalnych. Poniżej podano ogólne uwagi dotyczące wyboru mediów do chromatografii żelowej:

• Zakres frakcjonowania
• Granica wykluczenia wielkości
• Ciśnienie robocze
• Przepływ
• Wysokość przepływu
• Wysokość lepkości próbki
• Zakres pH
• Autoklawowalność
• Tolerancja na mieszające się z wodą rozpuszczalniki organiczne; niektóre próbki mogą być bardziej rozpuszczalne w mieszance wodno-organicznej
• Tolerancja dla detergentów, środków chaotropowych, formamidu itp.
• Temperatura pracy

Typy próbek, wybór mediów i konfiguracja systemu chromatograficznego określą, które parametry są najważniejsze dla danego zastosowania oczyszczania.

.