ChIP off the old block: Beyond chromatin immunoprecipitation

A host of techniques are building from a classic method-chromatin immunoprecipitation (ChIP)- to assess what binds to DNA and where. Pojawiające się techniki zmniejszają rozmiar próbek, badają kompleksy białkowe związane z DNA lub dokładniej oceniają zaangażowane nukleotydy. Wszystkie te podejścia mają na celu przezwyciężenie długotrwałych ograniczeń ChIP i poszerzenie zakresu pytań, jakie naukowcy mogą zadawać na temat regulacji genów, rozwoju i chorób.

Immunoprecypitacja chromatynowa, jedna z najczęściej stosowanych technik w biologii molekularnej, została wynaleziona ponad 30 lat temu – i niektóre rzeczy w niej się zmieniły, podczas gdy inne pozostały takie same.

Podstawowy protokół jest nadal podobny do tego opracowanego w latach 80-tych, obejmującego sieciowanie białek do DNA za pomocą formaldehydu, a następnie fragmentację DNA. Białko oddziałujące z DNA jest immunoprecypitowane przy użyciu przeciwciała, wiązania krzyżowe są odwracane za pomocą ciepła, a związane z nim DNA analizowane. Naukowcy połączyli później tę technikę z głębokim sekwencjonowaniem, opracowując technikę ChIP-seq do badania interakcji białko-DNA w skali genomowej.

ChIP został wykorzystany do badania działania czynników transkrypcyjnych, modulacji ekspresji genów przez histony i innych podstawowych pytań mających wpływ na rozwój biologiczny i choroby. We wrześniu C. David Allis i Michael Grunstein otrzymali prestiżową nagrodę Laskera za pracę nad histonami – badania, które opierały się na ChIP. ChIP-seq jest obecnie kamieniem węgielnym projektu ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements), którego celem jest mapowanie regulacyjnych regionów genomu w różnych typach komórek.

Biolodzy chromatynowi rozwijają również cały wachlarz technologii spin-off lub równoległych, aby wyjść poza to, co oferują ChIP i ChIP-seq – zbadać kompleksy białek, dokładniej ocenić dokładne nukleotydy, z którymi wiąże się czynnik, przyjrzeć się małym pulom komórek i zacząć, nieśmiało, oceniać interakcje białko-DNA na poziomie pojedynczej komórki.

Wszystkie te techniki mają na celu zrobienie rzeczy, których sama ChIP-seq nie może zrobić, lub robi to bardzo powoli. I wszystkie z nich mają ten sam podstawowy cel: dowiedzieć się, jakie cząsteczki są związane z DNA i gdzie.

„Naprawdę nie rozumiemy podstawowych zasad, według których funkcjonalne sekwencje regulacyjne w naszym genomie określają, gdzie i kiedy włączają się geny”, mówi Bradley Bernstein, dyrektor Programu Epigenomiki w Broad Institute w Cambridge, Massachusetts. Dodaje, że ChIP jest „ograniczony pod wieloma względami. I dlatego są te wysiłki, aby spróbować i innowacyjne nowe podejścia lub dostosować technologię w nowy sposób.”

„Musimy wymyślić precyzyjne, deterministyczne sposoby bezpośredniej oceny interakcji pojedynczych cząsteczek systematycznie w pojedynczych komórkach.”

Making it work

„Nazywanie ciemną sztuką to za dużo” – mówi Nir Friedman, profesor informatyki i biologii na The Hebrew University of Jerusalem w Izraelu. Ale pomimo tego, że jest to powszechnie stosowana technika, „bardzo niewiele osób jest wystarczająco cierpliwych, aby skalibrować swoje eksperymenty”, mówi.

Doświadczenia ChIP-seq generują dużo szumu, zauważa Friedman. Formaldehyd może usieciować niezaangażowane cząsteczki, przeciwciała mogą ściągać nie docelowe białka, a sonikacja – najczęstszy sposób rozbijania DNA – ma tendencję do rozbijania DNA, które jest w otwartej konformacji. Friedman mówi: „Może się okazać, że ponad połowa tego, co kończymy sekwencjonować lub na co patrzymy, to wiązania niespecyficzne”.

ENCODE publikuje wytyczne dotyczące oceny jakości przeciwciał i odsiewania bezsensownych danych, zauważa Friedman. Projekt zapewnia również dostęp do najnowszych narzędzi obliczeniowych, które są wykorzystywane, na przykład, do normalizacji danych do kontroli i identyfikacji „szczytów” lub regionów możliwego wiązania DNA.

Wybieranie odpowiedniego przeciwciała, w szczególności, może być wyzwaniem, zauważa Michael-Christopher Keogh, główny oficer naukowy w EpiCypher, firmie epigenomicznej w Research Triangle Park, Durham, Karolina Północna. Keogh brał udział w niedawnym badaniu pokazującym, że wiele przeciwciał popularnych w badaniach nad histonami słabo sprawdza się w ChIP, na przykład wiążąc się z epitopami poza celem. W badaniu zaproponowano również kroki walidacji wykraczające poza wytyczne ENCODE.

Niektórzy badacze omijają problem z przeciwciałami poprzez inżynierię znacznika epitopu na ich celu, jak w przypadku CETCh-seq (CRISPR epitope tagging ChIP-seq). Stosowana od dawna technika, DamID (identyfikacja metylotransferazy adeninowej DNA), obejmuje inżynierię czynników do znakowania sąsiedniego DNA znacznikami molekularnymi.

Inni badacze wciąż udoskonalają podstawową technikę ChIP, jak na przykład grupa Alona Gorena z Wydziału Medycyny Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego, która w pełni zautomatyzowała ChIP-seq. Goren twierdzi, że optymalne stężenie przeciwciał może się znacznie różnić w zależności od przeciwciał i typów komórek, a niektóre etapy, takie jak odwrotne sieciowanie, są zbędne. Laboratorium Goren wykazało również, że przeciwciała monoklonalne mają przewagę nad przeciwciałami poliklonalnymi.

Ale nawet po pełnej optymalizacji, ChIP-seq jest nadal zasadniczo ograniczony. Na przykład, generalnie wymaga 100 000 lub więcej komórek do oceny czynników transkrypcyjnych i 10 000 lub więcej do oceny białek histonowych, mówi Goren. W większości przypadków metoda ta jest nastawiona na badanie jednego białka i jednego przeciwciała na raz.

Mówi Goren, „Kiedy będziemy w stanie przesunąć widok z myślenia o białkach na myślenie o kompleksach, uzyskamy znacznie lepsze zrozumienie tego, jak działa biologia i co się dzieje w chorobie.”

Getting a handle on protein complexes

Jednym z podejść do badania kompleksów jest połączenie ChIP-seq ze spektrometrią mas (MS), przy użyciu metod takich jak RIME (Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins) i ChIP-MS.

Jedną wadą tych metod jest jednak to, że białka niezwiązane z DNA mogą być również ściągnięte przez immunoprecypitację, mówi David Steger, biolog molekularny z Uniwersytetu Pensylwanii w Filadelfii. Zamiast tego, mówi Steger, „wszyscy starają się rozwijać proteomikę specyficzną dla danego miejsca w konkretnym enhancerze”.

Jedną z pojawiających się technik oceny kompleksów związanych z chromatyną jest ChIP-SICAP (selektywna izolacja białek związanych z chromatyną), opracowana przez zespół Jeroena Krijgsvelda z German Cancer Research Center w Heidelbergu, Niemcy, i jego współpracowników. Technika ta polega na znakowaniu DNA związanego z przeciwciałami biotyną, które są następnie ściągane za pomocą kulek streptawidyny wiążących biotynę przed przeprowadzeniem specjalizacji masowej.

Steger stosuje ChIP-SICAP do badania białek związanych ze wzmacniaczami, które napędzają przemianę mezenchymalnych komórek macierzystych w adipocyty. Mówi Steger: „To, co próbujemy zrobić, to zidentyfikować proteom enhancera”.

Inne podejścia wykorzystują system edycji genów z udziałem Cas9, który rozpoznaje przewodnikowe RNA ukierunkowane na specyficzne sekwencje DNA. Naukowcy znakują Cas9 biotyną lub enzymem, który promuje znakowanie biotyną pobliskich białek, które są analizowane przez MS. Metoda ta została również wykorzystana do ujawnienia interakcji pomiędzy odległymi elementami genomu. Takie metody mogłyby potencjalnie rozszerzyć repertuar metod związanych z ChIP-seq, które mogą ocenić trójwymiarową architekturę genomu, takich jak Hi-C, ChIA-PET (Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag sequencing) i HiChIP, a także nowsze metody, takie jak SPRITE (Split-Pool Recognition of Interactions by Tag Extension).

Te pojawiające się metody oceny kompleksów związanych z DNA obiecują wyostrzyć spojrzenie biologów na regulację genów. Ale kiedy zaprzęgnięte są do MS, napotykają na ograniczenie, że MS nie wykrywa łatwo białek o niskiej liczebności, zauważa Steger. Co więcej, nie wszystkie nowsze techniki są dostępne dla osób nie będących ekspertami.

Kilka firm oferuje usługi outsourcingu bardziej uznanych technik, takich jak RIME lub ChIP-seq. Firmy, które oferują ChiP-seq i powiązane usługi obejmują Active Motif, w Carlsbad, Kalifornia; Diagenode w Liege, Belgia i Denville, New Jersey; oraz Novogene z siedzibą w Pekinie. Te i inne firmy oferują również zestawy i komponenty ChIP-seq, chociaż wiele laboratoriów wytwarza własne odczynniki. Keogh zauważa również, że badania wewnętrzne mogą oznaczać większą kontrolę nad etapami optymalizacji.

Opieka nad parametrami eksperymentalnymi podczas eksperymentów ChIP może sama w sobie podnieść jakość danych, mówi Cigall Kadoch, której grupa bada kilka dużych wielkocząsteczkowych kompleksów białkowych w Dana-Farber Cancer Institute i Harvard Medical School w Bostonie, Massachusetts.

Kadoch jest ostrożna, aby zoptymalizować stężenie formaldehydu używanego do sieciowania białek ze sobą i DNA, dla każdego przeciwciała i typu komórek. Przy wyborze przeciwciał zwraca uwagę na to, czy przewidywany epitop jest dostępny na powierzchni, a więc czy może być wykorzystany do immunoprecypitacji. A żeby zobaczyć ślad DNA w pełni zmontowanego kompleksu, radzi wybrać przeciwciało przeciwko białku, które jest dodawane późno w procesie składania. „To są rzeczy, które decydują o powodzeniu lub niepowodzeniu projektu” – mówi Kadoch.

Zeroing in on factor binding

Inną techniką stosowaną przez Stegera jest ChIP-exo (ChIP exonuclease). Stosuje ją do identyfikacji – z rozdzielczością pary bazowej – gdzie różne czynniki wiążą się z genomem.

Ta technika zaczyna się od fragmentacji DNA przez sonikację. Egzonukleaza przeżuwa DNA (w kierunku 5′-3′) do krawędzi miejsca, gdzie DNA jest połączone przez formaldehyd z białkiem. Takie podejście skutkuje ostrym „śladem” DNA dla związanych czynników, który może być dokładniejszy niż wnioskowane motywy generowane obliczeniowo przy użyciu ChIP-seq.

„Zawsze zaczynamy od ChIP-seq, a gdy nasze pytania ewoluują, przechodzimy do ChIP-exo,” mówi Steger, który użył tej techniki do oceny wiązania receptora glukokortykoidów do DNA. Receptor wiąże się jako dimer z dwiema przylegającymi do siebie, krótkimi sekwencjami DNA. Steger był w stanie rozstrzygnąć wiązanie jednego monomeru, czego nie był w stanie zrobić za pomocą ChIP-seq.

Zespół Franka Pugha, profesora biochemii i biologii molekularnej na Penn State University w University Park w Pensylwanii, uprościł ostatnio swoją metodę ChIP-exo i dostosował ją do powszechnie stosowanej platformy sekwencjonowania Illumina. Podobnie Julia Zeitlinger, badaczka w Stowers Institute for Medical Research w Kansas City, Missouri, i jej współpracownicy opublikowali pokrewną technikę, ChIP-nexus. Oba postępy są „obiecujące”, mówi Michael Snyder, przewodniczący katedry genetyki i dyrektor Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine na Uniwersytecie Stanforda w Kalifornii.

Mniejsze i głębsze

Badacze byli w stanie zmniejszyć liczbę komórek wymaganych do ChIP-seq poprzez dostosowanie parametrów eksperymentalnych, takich jak użycie wysokiej jakości przeciwciał, mówi Friedman.

Niektóre techniki, w tym jedna opracowana przez Friedmana, wykorzystują adaptory sekwencjonowania z kodem kreskowym, umożliwiając zmniejszenie rozmiaru próbki. A nowa technika zwana „ChIPmentacją” redukuje kroki związane z tworzeniem bibliotek sekwencjonowania.

Jedną z metod, która trafia do nowych laboratoriów jest CUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease), opracowana przez Steve’a Henikoffa i jego kolegów z Fred Hutchinson Cancer Research Center w Seattle, Washington. Metoda ta rezygnuje z sieciowania za pomocą formaldehydu, jak również z cięcia DNA za pomocą sonikacji. Zamiast tego, przeciwciało przeciwko celowi jest wiązane z nukleazą mikrokalkową (MNase), która jest aktywowana przez wapń, aby rozszczepić DNA po obu stronach celu. Powstałe fragmenty DNA są sekwencjonowane.

„Uzyskuje się dużą redukcję sygnału do szumu” w porównaniu do ChIP-seq, mówi John Stamatoyannopoulos, dyrektor Altius Institute for Biomedical Sciences w Seattle. Wynika to po części z czystego cięcia DNA przez nukleazę, z niskim poziomem cięcia poza miejscem badania. W rezultacie CUT&RUN wymaga zwykle mniejszej liczby odczytów sekwencjonowania DNA niż ChIPseq – co obniża koszty – i może być stosowany do znacznie mniejszej liczby komórek. Zespół Henikoffa zastosował ostatnio tę technikę do 1000 komórek dla czynnika transkrypcyjnego i 100 komórek dla modyfikacji histonów. Stamatoyannopoulos twierdzi, że metoda ta w dużej mierze wyparła ChIP-seq w jego laboratoriach.

CUT&RUN ma również zalety wykraczające poza niską liczbę komórek. Stuart Orkin, biolog molekularny i profesor na Uniwersytecie Harvarda, chwali tę technikę za jej rozdzielczość „na poziomie nukleotydów”. Dzięki niewielkim zmianom w narzędziach obliczeniowych, jego grupa była w stanie rozróżnić blisko siebie położone miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego zaangażowanego w kontrolę ekspresji hemoglobiny płodowej. Przed uzyskaniem tego wyniku nie był w stanie immunoprecypitować czynnika transkrypcyjnego za pomocą konwencjonalnego ChIP, prawdopodobnie dlatego, że sieciowanie formaldehydem ukrywało epitopy. CUT&RUN „zadziałał od razu”, mówi.

Laboratorium Henikoffa przystosowało tę technikę do oceny oddziaływań 3D DNA na duże odległości i do przeprowadzania immunoprecypitacji na rozszczepionych fragmentach przy użyciu drugiego przeciwciała. Grupa badała dwie cechy molekularne tego samego kompleksu białkowego – podejście, które może pomóc w rozwiązaniu problemów, takich jak to, które kombinacje znaczników histonowych są związane z różnymi stanami genów.

Praca na poziomie pojedynczej komórki

Dla wielu biologów molekularnych, w tym badaczy chromatyny, pojedyncza komórka jest ostateczną granicą.

„Musimy wymyślić precyzyjne, deterministyczne sposoby bezpośredniej oceny interakcji pojedynczych cząsteczek systematycznie w pojedynczych komórkach”, mówi Bernstein. „Jest to cel długoterminowy”. Dane z pojedynczych komórek mogłyby potencjalnie śledzić czynniki wiążące DNA, gdy komórki wychodzą ze stanu komórek macierzystych podczas rozwoju, lub w nowotworach o wysokim poziomie heterogeniczności komórkowej.

Kilka podejść zbliża się do tego celu. Jednak „wiele metod jednokomórkowych ma ograniczoną czułość” – mówi Christopher Benner, biolog genomu z Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego. Na przykład Bernstein i jego koledzy wygenerowali dane ChIPseq z pojedynczych komórek przy użyciu systemu mikroprzepływowego i kodowania kreskowego. Z każdej komórki technika ta wychwytywała od 500 do 10 000 unikalnych „odczytów”, reprezentujących zdarzenie wiązania DNA, w przeciwieństwie do milionów odczytów wychwytywanych w populacjach komórek.

Kilka metod może również dostarczyć danych na temat aktywnych regionów genomu. ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) wykorzystuje hiperaktywną transpozazę, która integruje się z genomem w otwartych regionach chromatyny i wprowadza adaptory sekwencjonowania. ATAC-seq może być zaadaptowana do pojedynczych komórek, a uzyskane dane sekwencyjne mogą być analizowane za pomocą różnych metod obliczeniowych. Te podejścia mogą, na przykład, zidentyfikować sekwencje promotora lub zidentyfikować wzorce w eksperymentach jednocześnie wybijających elementy kontrolne DNA lub oceniających ekspresję RNA.

ATAC-seq ma wady, takie jak niekompletna integracja w dostępnych regionach, zauważa Snyder. Jednak technika ta może być potężna: można ją zastosować do wprowadzania i obrazowania fluoroforów, co daje dane obrazowe o organizacji genomu 3D przed sekwencjonowaniem, zauważa Snyder.

„Możemy potrzebować całkowicie ortogonalnych sposobów robienia tego”, mówi Bern-stein o analizie chromatyny pojedynczych komórek. Ten cel prawdopodobnie zostanie osiągnięty z powodzeniem w końcu, mówi, z „technologiami, które są radykalnym odejściem od tego, czego używamy teraz.”

Wysyłanie informacji prasowych/opisów nowych produktów lub informacji o literaturze produktowej na adres [email protected]. Odwiedź stronę Science New Products, aby uzyskać więcej informacji.

Nowo oferowane oprzyrządowanie, aparatura i materiały laboratoryjne interesujące dla badaczy wszystkich dyscyplin w organizacjach akademickich, przemysłowych i rządowych są prezentowane w tym miejscu. Nacisk kładziony jest na cel, główne cechy i dostępność produktów i materiałów. Zatwierdzenie przez Science lub AAAS jakichkolwiek produktów lub materiałów wymienionych nie jest dorozumiane. Dodatkowe informacje można uzyskać od producenta lub dostawcy.

.