Chemiczna derywatyzacja w bioanalizie

Zastosowania

Chemiczna derywatyzacja od dawna sprawdza się jako technika analityczna w bioanalizie w celu przezwyciężenia problemów związanych z niską wydajnością jonizacji, niestabilnością związków, słabą selektywnością lub niedopuszczalną wydajnością chromatograficzną (słaba retencja, zły kształt piku i problemy z przenoszeniem), a nawet słabą lotnością przy rozdzielaniu GC. Technika ta jest potężnym narzędziem w wielu dziedzinach chemii, w tym w medycynie, kryminalistyce, nauce o żywności, kontroli dopingu i dyscyplinach środowiskowych. Celem derywatyzacji chemicznej jest modyfikacja struktury analitu (nukleofilu lub elektrofilu) za pomocą odczynnika chemicznego (elektrofilu lub nukleofilu w zależności od rodzaju analitu), w wyniku czego powstaje nowy związek (pochodna reakcji) o lepszych właściwościach chemicznych i fizycznych do analizy. Warunki reakcji (ilość reagentów, czas i temperatura reakcji, itp.) są optymalizowane w celu uzyskania pożądanej pochodnej z najwyższą możliwą wydajnością reakcji. Dodatkowe procedury oczyszczania próbki mogą być opracowane w celu wyeliminowania niepożądanych produktów ubocznych i nadmiaru odczynników, minimalizując w ten sposób inferencje analitu przy analizie.

Używając chemicznej derywatyzacji, analiza niemożliwego staje się możliwa. W literaturze przedstawiono wiele przykładów, które mają wpływ na detekcję GC, LC-MS/MS i NMR. Najbardziej godne uwagi było chromatograficzne rozdzielenie enancjomerów poprzez chiralną derywatyzację przy użyciu specyficznych odczynników rozwiązujących bez użycia specjalistycznych kolumn chiralnych i warunków rozdzielania.

Rozważania

Wybór odpowiedniego odczynnika chemicznego jest niezbędny dla udanej derywatyzacji i zależy od konkretnego zastosowania. Ogólnie rzecz biorąc, jeśli analit docelowy jest nukleofilem (związek z nadmiarem elektronów), jako odczynnik wybiera się elektrofil (związek z ogólnym niedoborem elektronów) i odwrotnie. Odczynniki muszą być selektywne (ukierunkowane na jedno określone miejsce w cząsteczce), co pozwala na uniknięcie derywatyzacji w wielu miejscach w cząsteczce docelowej, metabolitach lub składnikach endogennych. Na przykład, w przypadku cząsteczki zawierającej zarówno hydroksylowe, jak i aminowe grupy funkcyjne należy unikać stosowania chlorków kwasowych lub bezwodników jako odczynników derywatyzacyjnych, ponieważ derywatyzują one obie grupy funkcyjne. Przeciwnie, użycie chlorku dansylu jako odczynnika derywatyzacyjnego jest odpowiednie dla aminowych i fenolowych grup funkcyjnych, ponieważ nie reaguje on z alkoholami alifatycznymi. Inne wymagania, które należy rozważyć przy wyborze odczynnika, obejmują dostępność (w handlu), czystość i koszt. Zazwyczaj koszt odczynników jest minimalny, a zatem nie stanowi bariery dla ich stosowania.

Przy zastosowaniu zoptymalizowanych warunków, procedury chemicznej derywatyzacji są zazwyczaj wystarczająco solidne, aby mogły być stosowane do bioanalizy farmaceutycznej i są w stanie spełnić oczekiwania regulacyjne. Jest to zwykle wykazywane podczas rygorystycznego procesu walidacji, gdzie kilka parametrów, w tym, ale nie tylko, dokładność, precyzja, selektywność, efekt matrycy, itp. Wybór wzorca wewnętrznego jest niezbędny do skorygowania wszelkich możliwych strat analitu podczas różnych etapów postępowania z próbką i bioanalizy; zapewniając w ten sposób solidność oznaczenia. Jeżeli jest to możliwe, powinien być użyty wzorzec wewnętrzny stabilny deuterem lub 13C, w przeciwnym razie można zastąpić go analogiem o podobnej reaktywności, odzysku i właściwościach chromatograficznych. Ponadto, konieczne jest rozważenie i ocena, gdzie to możliwe, szlaków metabolicznych analitu zainteresowania; konwersja metabolitów z powrotem do cząsteczki macierzystej musi być unikana podczas procedury derywatyzacji, ponieważ procesy te często wiążą się z trudnymi warunkami (pH, ciepło, długie czasy inkubacji, itp.). Niestety, może to być skomplikowane przez brak standardów referencyjnych dla metabolitów i brak informacji metabolicznych na wczesnym etapie cyklu rozwoju leku z powodu zróżnicowanych lub przyspieszonych strategii rozwoju.

Chemiczna derywatyzacja jako forma sztuki

Użycie chemicznej derywatyzacji zmniejszyło się w ostatnich latach, ponieważ nowe technologie separacji rozwinęły się i stały się bardziej powszechne. Ewolucja nadkrytycznej chromatografii cieczowej (SFC), na przykład, otworzyła nową drogę dla chiralnej analizy stereoizomerycznej; tym samym zmniejszając potrzebę chiralnej derywatyzacji w niektórych przypadkach. Bardziej czułe generacje spektrometrii mas z potrójnym kwadrupolem, z nowymi lub ulepszonymi technologiami jonizacji, przesuwają granice wykrywalności do niskich poziomów pikogramowych, w wyniku czego zapotrzebowanie na chemiczną derywatyzację w celu poprawy czułości analizy (poprzez ulepszoną jonizację lub selektywność) zmniejszyło się. Inne technologie, w tym UHPLC, mikro-/nano-LC (dla lepszej wydajności jonizacji), instrumenty TOF z możliwością mobilności jonów (rozdział elektroniczny, a nie chemiczny/fizyczny) również przyczyniły się do spadku znaczenia derywatyzacji chemicznej w laboratoriach bioanalitycznych. Mimo to, technika ta jest nadal stosowana w przypadku bardzo złożonych rozdziałów, gdzie wyżej wymienione technologie nie mogą zapewnić odpowiedniego efektu. Czasami sprzężenie chemicznej derywatyzacji z jedną z tych technologii ma wzmocniony/addytywny wpływ. W szczególności, połączenie SFC z chiralną derywatyzacją okazało się lepsze dla separacji chiralnej w porównaniu z analizą SFC (dane nie pokazane).

Dzięki temu spadkowi techniki i jej złożoności w porównaniu z innymi technikami analitycznymi, chemiczna derywatyzacja stała się specjalistyczną „formą sztuki” w laboratorium, wymagającą specjalistycznych umiejętności w połączeniu z dużą biegłością chemiczną. W konsekwencji, coraz mniej naukowców w środowisku DMPK jest w stanie opanować tę technikę i stać się biegłymi w jej stosowaniu. Pojawia się więc pytanie, jak zachować te umiejętności i przekazać je przyszłym pokoleniom naukowców zajmujących się analityką. Numery specjalne takie jak ten, artykuły przeglądowe, rozdziały książek, wskazówki zawierające protokoły eksperymentalne mają nadzieję ułatwić i promować wykorzystanie derywatyzacji chemicznej jako doskonałego narzędzia analitycznego.

Outline

Ten numer tematyczny obejmuje postępy w istniejących technikach derywatyzacji stosowanych w badaniach bioanalitycznych, jak również innowacyjne nowe metody i podejścia (np, połączenie derywatyzacji z mikroprzepływową LC-MS oraz koncepcja nowych technik znakowania chemicznego autorstwa Niwy i wsp. ).

W numerze staramy się omówić aspekty związane z:

• Metod derywatyzacji w bioanalizie LC-MS (w tym HPLC);

• Derywatyzacji peptydów do analizy terapeutyków białkowych;

• Chiralnych odczynników derywatyzacyjnych stosowanych do próbek biologicznych (patrz Vashistha i in. );

• Derywatyzacja do analizy związków endogenicznych (patrz 'Beyond Classical Derivatization: Analyte 'derivatives’ in the bioanalysis of endogenous and exogenous compounds” Barnaby et al. , lub „Derivatization of steroids in biological samples for GC-MS and LC-MS analyses” Marcos et al. );

• Procedury derywatyzacji w kontroli dopingowej u ludzi (patrz ciekawy przegląd Athanasiadou et al. ).

Prawdą jest, że derywatyzacja chemiczna jest tylko kolejnym narzędziem w zestawie narzędzi bioanalitycznych, ale jest to „must have” dla laboratorium DMPK, które nadal będzie miało wpływ na rozwiązywanie wielu wyzwań bioanalitycznych.

Dlatego, jeśli nie lubisz swojego analitu, zmień go (za pomocą derywatyzacji chemicznej)!

.