Calcium Alginate and Calcium Alginate-Chitosan Beads Containing Celecoxib Solubilized in a Self-Emulsifying Phase
Abstract
W niniejszej pracy opracowano kulki alginianowe i alginianowo-chitozanowe zawierające celekoksyb rozpuszczony w fazie samoemulgującej w celu uzyskania systemu dostarczania leku do podawania doustnego, zdolnego do opóźniania uwalniania leku w środowisku kwaśnym i promowania go w przedziale jelitowym. Uzasadnieniem tej pracy było dążenie do poprawy skuteczności terapeutycznej celekoksybu poprzez zmniejszenie jego żołądkowych działań niepożądanych oraz preferowanie jego zastosowania w profilaktyce raka jelita grubego i jako adiuwantu w terapii polipowatości rodzinnej. Układy przygotowano metodą żelowania jonotropowego przy użyciu igieł o różnych średnicach (400 i 600 μm). Badano morfologię, wielkość cząstek, pęcznienie oraz uwalnianie leków in vitro z kulek w środowisku wodnym o różnym pH. Wyniki eksperymentalne wykazały, że obecność chitozanu w formulacji powoduje zwiększenie odporności mechanicznej struktury perełek, a w konsekwencji ograniczenie zdolności pęcznienia perełek i zmniejszenie szybkości uwalniania leku w neutralnym pH. Kulki alginianowo-chitozanowe mogą być dobrym narzędziem gwarantującym dostarczanie celekoksybu do jelita grubego.
1. Wprowadzenie
Systemy dostarczania leków zawierające biodegradowalne polimery naturalne są przedmiotem coraz większej liczby badań z uwagi na korzyści, jakie te materiały mogą zaoferować. Wśród nich, te zawierające alginian i chitozan zostały szeroko wykorzystane w dziedzinie farmacji.
Alginian jest rozpuszczalnym w wodzie naturalnym biopolimerem pozyskiwanym z alg brunatnych i składającym się z naprzemiennych bloków 1-4 reszt kwasu α-L-guluronowego i β-D-mannuronowego. Polimer ten tworzy hydrożele w obecności kationów dwuwartościowych, takich jak Ca2+, Ba2+, Sr2+ i Zn2+ i ta właściwość pozwala na przygotowanie kulek zawierających leki. W mechanizm tego procesu żelowania zaangażowane są reszty guluronowe, które przy specyficznej chelatacji Ca2+ tworzą tzw. strukturę „egg-box”. Wielu badaczy skupiło swoją uwagę na rozwoju kulek alginianu wapnia jako systemów kontrolowanego dostarczania leków do doustnego podawania cząsteczek leków i białek.
Chitozan jest biokompatybilnym, biodegradowalnym, nietoksycznym, liniowym polisacharydem składającym się z jednostek D-glukozaminy i N-acetylo-D-glukozaminy połączonych wiązaniami β-(1-4) glikozydowymi. Chitozan można uzyskać poprzez częściową deacetylację chityny z muszli skorupiaków i jest on szeroko stosowany do hodowli komórkowych, dostarczania leków i dodatków do żywności .
Sieciowe łączenie alginianu i chitozanu w hydrożel jest stosowane w celu uzyskania materiałów przydatnych do zastosowań medycznych i farmaceutycznych; uzyskane systemy charakteryzują się zwiększoną stabilnością w porównaniu do tych uzyskanych z pojedynczym polimerem . W kontrolowanym dostarczaniu leków kompleks polielektrolitowy alginian-chitozan otrzymał wiele uwagi w ostatnich latach. Oba polimery tworzą kompleks polielektrolitowy poprzez oddziaływanie jonowe pomiędzy resztami karboksylowymi alginianu i resztami aminowymi chitozanu. Kulki alginianowo-chitozanowe mogą być wytwarzane różnymi metodami: dwuetapową i jednoetapową. W pierwszej z nich kulki żelowe z alginianu wapnia wytwarza się poprzez wkraplanie roztworu alginianu do kąpieli żelującej zawierającej jony wapnia. Otrzymane kulki są następnie przenoszone do roztworu chitozanu w celu utworzenia na ich powierzchni membrany. Jednoetapowa procedura wymaga, aby krople roztworu alginianu wpadały do roztworu wodnego zawierającego zarówno substancję żelującą dla alginianu (np. jony wapnia), jak i chitozan . Wybór metody produkcji jest odpowiedzialny za właściwości kulek ze względu na ilość związanego chitozanu w otrzymanym produkcie. Jednocześnie na właściwości kulek wpływa masa cząsteczkowa wybranych polimerów i/lub procentowy udział różnych reszt w cząsteczkach polimeru .
Celecoxib, fluorowana pochodna benzenosulfonamidu, jest niesteroidowym lekiem przeciwzapalnym (NSAID) o wysoce selektywnym działaniu hamującym cyklooksygenazę-2 (COX-2). Posiada działanie przeciwzapalne, przeciwbólowe i przeciwgorączkowe dzięki hamowaniu syntezy prostaglandyn katalizowanej przez COX-2. Ostatnio lek ten jest często badany pod kątem aktywności przeciwnowotworowej z wykorzystaniem modeli in vitro i in vivo. Badania przedkliniczne nad celekoksybem wykazały znaczącą aktywność przeciwnowotworową wobec raka płaskonabłonkowego głowy i szyi, raka jelita grubego, raka piersi i raka płuc
W niniejszej pracy opracowano kulki alginianowe i alginianowo-chitozanowe zawierające celekoksyb rozpuszczony w fazie samoemulgującej w celu uzyskania systemu dostarczania leku do podawania doustnego, zdolnego do opóźniania uwalniania leku w środowisku kwaśnym i promowania go w przedziale jelitowym. Uzasadnieniem dla podjęcia tych prac była chęć poprawy skuteczności terapeutycznej celekoksybu, zmniejszającej jego żołądkowe działania niepożądane i sprzyjającej jego zastosowaniu w profilaktyce raka jelita grubego oraz jako adiuwantu w terapii polipowatości rodzinnej. Celem niniejszej pracy była ocena i porównanie właściwości kulek z alginianu wapnia i alginianu wapnia z chitozanem, zawierających celekoksyb. Badano morfologię, wielkość cząstek, pęcznienie oraz uwalnianie leku in vitro w środowisku wodnym o różnym pH.
2. Materiały i metody
2.1. Materials
Celecoxib was obtained from Chemos GmbH (Regenstauf, Germany). Bezwodny chlorek wapnia i alginian sodu (masa cząsteczkowa 120000-190000 g/mol; stosunek reszt mannuronowych do guluronowych 1,56) zakupiono w firmie Sigma Aldrich (Mediolan, Włochy), natomiast niskocząsteczkowy chitozan pochodził z firmy Fluka (Mediolan, Włochy). Labrasol (kaprylocaproyl macrogol-8 glycerides) był darem firmy Gattefossè (Mediolan, Włochy); TPGS (D-α-tocopheryl polyethylenglycol 1000 succinate) był uprzejmie ofiarowany przez Isochem (Gennevillers, Francja). Wszystkie inne substancje chemiczne były klasy analitycznej.
2.2. Przygotowanie kulek z alginianu wapnia
Kulki z alginianu wapnia zostały przygotowane metodą żelowania z użyciem jonów wapnia jako środka sieciującego. Szczegółowo, 1,5% (w/w) wodny roztwór alginianu sodu został zmieszany z fazą samoemulgującą zawierającą lek w stosunku 4 : 1 i dodawany kropla po kropli do 100 mM roztworu CaCl2 . Fazę samoemulgującą przygotowywano mieszając odważone ilości Labrasolu i TPGS w temperaturze 50°C i rozpuszczając celekoksyb w roztworze substancji pomocniczej. Emulsję (roztwór alginianu sodu i fazę samoemulgującą) wytłaczano ręcznie w kąpieli utwardzającej przez igły o średnicy wewnętrznej 400 lub 600 μm, pod stałym delikatnym mieszaniem, w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach zbierano kulki, przemywano je wodą dejonizowaną w celu usunięcia nadmiaru jonów wapnia, a następnie suszono w temperaturze 40°C przez noc. Skład przygotowanych preparatów, oznaczonych kodami CAl 600 i CAl 400, zestawiono w tabeli 1.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.3. Przygotowanie kulek alginianu wapnia-chitozanu
Kulki alginianu wapnia-chitozanu (oznaczone jako CAlCh 600 i CAlCh 400) przygotowano zgodnie z metodą jednoetapową. Procedura była identyczna jak w przypadku kulek alginianowych z tą różnicą, że kąpielą utwardzającą był 0,2% (wagowo) roztwór chitozanu w rozcieńczonym kwasie octowym (1%) zawierający CaCl2 o stężeniu 100 mM. Skład preparatów chitozanowych podano w tabeli 1.
2.4. Analiza morfologiczna i wielkości cząstek
Morfologię mokrych i wysuszonych kulek oraz wielkość cząstek wysuszonych kulek analizowano przy użyciu stereomikroskopu Motic SMZ168 i oprogramowania do analizy obrazu (Motic Image Plus 2.0). Dla każdej formulacji wielkość cząstek obliczono jako średnią wartość wielkości 20 wysuszonych cząstek.
2.5. Zawartość leku
Sześć miligramów wysuszonych kulek obciążonych lekiem rozpuszczano w roztworze buforu fosforanowego (100 mL) o pH 6,8 z dodatkiem 0,75% (w/v) laurylosiarczanu sodu w temperaturze 70°C pod mieszaniem przez dwie godziny. Po schłodzeniu otrzymane roztwory przesączano i analizowano spektrofotometrycznie przy długości fali 255 nm; wyniki stanowią średnią z co najmniej trzech oznaczeń.
2.6. Badanie pęcznienia
Badania pęcznienia przeprowadzono w temperaturze 37°C na wysuszonych kulkach umieszczonych w trzech mediach wodnych charakteryzujących się różnym pH: kwasie solnym o pH 1,0 i buforze fosforanowym o pH 6,8 i pH 7,4.
Dokładnie odważone ilości wysuszonych kulek alginianu wapnia i alginianu wapnia-chitozanu umieszczano w szklanych fiolkach zawierających po 5 mL każdego płynu. Po ustalonych odstępach czasowych (5, 15, 30, 60 i 120 minut), próbki były odzyskiwane, delikatnie wycierane papierem i ponownie ważone. Dynamiczna zmiana masy kulek w odniesieniu do czasu, określona jako stopień spęcznienia (Sw), została obliczona zgodnie z następującym równaniem:gdzie jest masą kulek w stanie spęcznienia w czasie i jest początkową masą wysuszonych kulek .
2.7. Badania uwalniania celekoksybu
Badania uwalniania in vitro przeprowadzono w kwasie solnym o pH 1,0 i w buforze fosforanowym o pH 6,8, a przy pH 7,4 dodano 0,75% laurylosiarczanu sodu, aby zagwarantować utrzymanie warunków zlewu. Badania przeprowadzono poprzez umieszczenie dokładnie odważonych ilości każdego preparatu, równoważnych 8 mg celekoksybu, w 500 mL wybranego płynu, w temperaturze 37°C, przy prędkości obrotowej 100 obr/min (aparat 2, łopatka). Przefiltrowane próbki pobierano w określonych odstępach czasu bez wymiany i analizowano na zawartość celekoksybu za pomocą spektrofotometru UV przy długości fali 255 nm, gdy płynem był HCl i bufor fosforanowy o pH 6,8 lub przy 256 nm w przypadku buforu fosforanowego o pH 7,4. Każdy eksperyment wykonano w trzech egzemplarzach.
Uwalnianie leku z kulek alginianu wapnia i alginianu wapnia-chitozanu porównano przy użyciu parametrów rozpuszczania t10%, t50% i t90%, które wskazują punkty czasowe, w których 10%, 50% i 90% leku zostało uwolnione oraz parametru podobieństwa f2 . Aby krzywe można było uznać za podobne, wartości f2 powinny być zbliżone do 100, a wartości f2 większe niż 50 (50-100) zapewniają identyczność lub równoważność dwóch krzywych.
2.8. Analiza statystyczna
Wyniki poddano analizie statystycznej w celu sprawdzenia istotnych różnic za pomocą testu t-Studenta, przy 95% przedziale ufności; wartości mniejsze niż 0,05 uznano za istotne statystycznie.
3. Wyniki i dyskusja
Perełki alginianowe i alginianowo-chitozanowe otrzymywano metodą żelowania jonotropowego upuszczając emulsję, złożoną z wodnego roztworu alginianu i fazy samoemulgującej obciążającej lek, przez igły 23 G (600 μm) lub 27 G (400 μm), w kąpieli żelującej z chlorku wapnia lub w kąpieli żelującej z chlorku wapnia i chitozanu. Substancjami pomocniczymi wybranymi do fazy samoemulgującej były Labrasol, płynny składnik o właściwościach samoemulgujących i zwiększających rozpuszczalność oraz bursztynian D-α-tokoferylu polietylenoglikolu 1000 jako koemulgator i środek zwiększający wchłanianie (tabela 1). Skład fazy samoemulgującej był taki sam jak w poprzedniej pracy .
Stereomikroskopowe obrazy mokrych i suchych kulek alginianowych i alginianowo-chitozanowych przedstawiono na rysunkach 1 i 2. Bezpośrednio po przygotowaniu kulki CAl 600 (rys. 1(a)) wykazują regularny kształt i jednorodne wymiary; są białe i nieprzezroczyste, o gładkiej, błyszczącej i jednorodnej powierzchni.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
Proces suszenia nie zmienia kształtu paciorków, ale prowadzi do zmniejszenia ich wymiarów i modyfikuje cechy ich powierzchni, która jest nieregularna i pomarszczona (Rysunek 1(b)). Utrata wody powoduje zmniejszenie odległości między łańcuchami polimerowymi i zmianę struktury kulek, która nie jest zwarta i ciągła, lecz składa się z małych mikrojąderek przylegających do siebie. W pełni spęcznione cząstki CAlCh 600 mają lekko żółty kolor, dość regularny kształt i gładką powierzchnię (rys. 1(c)). W tym przypadku proces suszenia wpływa na sferyczny kształt kulek (rysunek 1(d)); stają się one elipsoidalne, ich wymiar maleje, a powierzchnia jest bardzo chropowata. Ponadto, po wysuszeniu obserwuje się częściową aglomerację powierzchni kulek: jest to związane z właściwościami adhezyjnymi chitozanu. W przypadku kulek przygotowanych przy użyciu igły o średnicy 400 μm (rys. 2(a)-2(c)), obrazy zarejestrowane bezpośrednio po przygotowaniu świadczą o tym, że dla obu formulacji (z chitozanem lub bez) cząstki nie są jednorodne pod względem średnicy, nawet jeśli mają regularny kształt. Suche kulki CAl 400 i CAlCh 400 (rysunek 2(b)) mają powierzchnię charakteryzującą się asperity i concavity; ponadto w przypadku preparatu alginianowo-chitozanowego kształt cząstek jest całkowicie nieregularny i dobrze widoczna jest obecność stałych mostków chitozanu, które wiążą kulki utrudniając ich rozdzielenie.
Średni rozmiar kulek obciążonych celekoksybem wynosi od 715 do 896 μm (tabela 2). Na średnicę kulek istotny wpływ miała średnica igły użytej podczas preparatyki (). Dodatek chitozanu do kulek alginianowych zmienia istotnie ich wymiary tylko w przypadku zastosowania igły o średnicy 400 μm (). Ponadto, na co wskazują wysokie wartości odchylenia standardowego, przy zastosowaniu igły 400 μm produkt końcowy stanowi rodzinę cząstek niejednorodnych pod względem wymiarów.
|
||||||||||||||||||||||||
Wszystkie preparaty zawierają dużą ilość leku (tab. 2) jednorodnie rozmieszczonego w matrycy substancji pomocniczej, a różnice pomiędzy zawartością leku nie były istotne z wyjątkiem CAlCh 400 nieznacznie niższej od pozostałych (). Procentowa zawartość celekoksybu w kulkach przekracza wartość teoretyczną i jest to spowodowane utratą Labrasolu w czasie utwardzania, co jest uzasadnione, biorąc pod uwagę wysokie powinowactwo tej substancji pomocniczej do wody, która wypycha ją z kulek do kąpieli żelującej.
Osobliwą właściwością układów mikrocząsteczek alginianowych lub alginianowo-chitozanowych w postaci suchej jest ich zdolność, po kontakcie z cieczą wodną, do rehydratacji, pobierania cieczy i ulegania procesowi pęcznienia, związanemu głównie z hydratacją grup hydrofilowych polimerów. Gdy płynem jest woda, wnika ona w głąb cząstek wypełniając pory wśród łańcuchów polimerowych i powodując istotne pęcznienie układu, bez erozji/dezintegracji. Wybierając płyny o różnym pH, zachowanie pęcznienia kulek może ulec zmianie. Z tego powodu oceniano zdolność pęcznienia alginianu wapnia i kulek alginianu wapnia-chitozanu w HCl o pH 1,0 i w roztworach buforu fosforanowego o pH 6,8 i 7,4 (rys. 3-5).
W środowisku kwaśnym (rysunek 3) nie ma różnic w zdolności pęcznienia czterech preparatów; w tym pH maksymalny stopień pęcznienia nie przekracza 60%. Kulki alginianowe i alginianowo-chitozanowe absorbują część płynu; ich masa początkowo wzrasta, a następnie pozostaje stała. W tym pH w układach alginianowych (CAl 600 i CAl 400) następuje protonowanie grup karboksylanowych polimeru zlokalizowanych na powierzchni cząstek i tworzy się warstwa kwasu alginowego. Nierozpuszczalność kwasu alginowego w tym płynie oraz tworzenie się wiązań wodorowych, odpowiedzialnych za wzrost stabilności struktury, utrudniają penetrację dodatkowego płynu do głębszych warstw cząstek, ograniczając ich pęcznienie. Takie samo zachowanie przy pęcznieniu obserwuje się dla układów CAlCh 600 i CAlCh 400. Nawet jeśli w środowisku kwaśnym chitozan jest wysoce rozpuszczalny i naładowany w celu przekształcenia jego jednostek aminowych w formę rozpuszczalną w NH3+, interakcja grup aminowych i protonowanych grup karboksylowych nie jest wystarczająco silna, aby promować pęcznienie. Tak więc, ograniczone zachowanie całkowitego pęcznienia jest zdominowane przez strukturę alginianu wapnia.
Rysunki 4 i 5 pokazują, że preparaty wykazują wysoką zdolność pęcznienia przy pH 6,8 i pH 7,4. W przypadku preparatu CAl 600 masa cząstek szybko wzrasta, osiąga szczyt po 30 minutach, a następnie gwałtownie maleje z powodu erozji/dezintegracji układu. Takie zachowanie może być spowodowane reakcją wymiany jonowej pomiędzy Na+ (obecnym w buforze fosforanowym) a Ca2+ związanym z grupami karboksylowymi alginianu. Jony jednowartościowe zastępują jony dwuwartościowe, powodując rozpad struktury „jajowatej” i zwiększenie odległości między łańcuchami polimerowymi, sprzyjając wchłanianiu płynu i pęcznieniu układów. Proces ten trwa do momentu, gdy ciśnienie osmotyczne w kulkach zrównoważy siłę wiązań sieciujących i splątań fizycznych, które zachowują strukturę kulek. W ten sposób cząsteczki zaczynają się rozpadać, a ich masa maleje.
Wyniki uzyskane z badania pęcznienia świadczą o tym, że kulki CAlCh 600 i CAlCh 400 charakteryzują się bardziej odporną strukturą w porównaniu z CAl 600 i CAl 400, co prawdopodobnie wynika z oddziaływań pomiędzy łańcuchami alginianu i chitozanu. Maksymalny stopień pęcznienia kulek chitozanowych jest niższy niż alginianu; układy alginian-chitozan są w stanie osiągnąć równowagę pęcznienia w ciągu około 30 minut i utrzymać swoją masę na stałym poziomie do końca testu. Prawdopodobnie interakcje pomiędzy tymi dwoma polimerami są odpowiedzialne za tworzenie się cząstek o znacznej odporności mechanicznej, co ogranicza wchłanianie płynu i dezintegrację struktury. Wreszcie, porównując zachowanie pęcznienia kulek CAl 400 vs CAl 600 oraz CAlCh 400 vs CAlCh 600 (ten sam skład, różna średnica igły użytej w procesie przygotowania), można zauważyć, że w buforach fosforanowych CAl 400 i CAlCh 400 osiągnęły maksimum pęcznienia wyższe niż odpowiednio CAl 600 i CAlCh 600.
Profile uwalniania leków uzyskane z różnych formulacji przy pH 1,0, 6,8 i 7,4 przedstawiono na rycinach 6-8. Na uwalnianie celekoksybu in vitro ma wpływ pH wybranego płynu: odsetek leku uwalnianego w środowisku kwaśnym w ciągu dwóch godzin jest dość niski i waha się od 12,70% do 24,53% (ryc. 6). Opóźnienie uwalniania celekoksybu można przypisać zmniejszonej zdolności układów do pęcznienia w tym płynie; ani skład kulek, ani ich średnica nie wpływają na wydajność uwalniania leku (wartości parametru f2 zawsze powyżej 50). Przy pH 1,0 proces uwalniania jest regulowany jedynie przez dyfuzję leku. Wynik ten pozwala na spełnienie pierwszego celu pracy badawczej, jakim jest zminimalizowanie uwalniania leku w środowisku kwaśnym w celu promowania i sprzyjania temu procesowi na poziomie jelitowym.
W buforze fosforanowym o pH 6,8 preparaty charakteryzują się zachowaniem uwalniającym lek, na które wpływ ma ich skład, a nie w znacznym stopniu wymiary (rysunek 7). W tym płynie układy początkowo pęcznieją, a następnie ulegają erozji/dezintegracji, w związku z czym proces uwalniania leku napędzany jest najpierw przez dyfuzję, a następnie przez relaksację polimerową. Kulki alginianowe (CAl 600 i CAl 400) są w stanie zakończyć uwalnianie celekoksybu w ciągu około ośmiu godzin; przeciwnie, nie więcej niż 75% leku załadowanego do kulek alginianowo-chitozanowych przechodzi do roztworu po tym samym czasie. Porównanie wyników uzyskanych z mikrocząstek alginianowych i alginianowo-chitozanowych ujawnia, że profile nie są podobne, a wartości f2 są niższe niż 50. Możliwym wyjaśnieniem takiego zachowania jest elektrostatyczne oddziaływanie pomiędzy grupami karboksylowymi alginianu i grupą aminową chitozanu, które poprawia odporność mechaniczną sieci polimerowej zmniejszając jej pęcznienie i erozję w pH 6,8.
Zaskakujące jest, że szybkość uwalniania celekoksybu spada głównie w przypadku formulacji CAlCh 400, nawet jeśli ta formulacja charakteryzuje się najmniejszym rozmiarem cząstek. Prawdopodobnie mała średnica i duża powierzchnia tych cząstek prowadzi do tworzenia się grubszej warstwy chitozanu wokół kulek, co stanowi duży opór dla wchłaniania płynu, a w konsekwencji dla uwalniania leku.
Również przy pH 7,4 różnice w wydajności uwalniania leku można przypisać raczej składowi preparatu niż wymiarom cząstek (rysunek 8). Wszystkie preparaty wykazywały prawie stałą szybkość uwalniania leku. Nie ma różnic między krzywymi uwalniania CAl 600 i CAl 400 oraz między krzywymi uwalniania CAlCh 600 i CAlCh 400; gdy chitozan znajduje się w kulkach, szybkość uwalniania leku maleje.
Te same wnioski wynikają z analizy wyników uwalniania leku poprzez parametry rozpuszczania (t10%, t50% i t90%) (tabela 3). Różnice w zachowaniu się kulek podczas uwalniania są wykrywalne również poprzez parametry rozpuszczania t10%, t50% i t90% i są dobrze widoczne dla czasu niezbędnego do uwolnienia 50 i 90% załadowanego leku. W roztworach buforów fosforanowych kulki alginianowo-chitozanowe wymagają dłuższego czasu do uwolnienia 50 i 90% celekoksybu w porównaniu do kulek alginianowych. Prawdopodobnie obecność kompleksu alginian-chitozan prowokuje wzrost zmarszczek strukturalnych, nieregularności i złożoności struktury paciorków, które utrudniają uwalnianie leku.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Leave a Reply