Badanie przepuszczalności Caco-2
Pytania i odpowiedzi dotyczące badania przepuszczalności Caco-2
Proszę o przedstawienie przeglądu badania przepuszczalności Caco-2 firmy Cyprotex.
Komórki Caco-2 są szeroko stosowane jako model in vitro do przewidywania wchłaniania leków u ludzi. Linia komórkowa Caco-2 wywodzi się z ludzkiego raka jelita grubego, a podczas hodowli komórki spontanicznie różnicują się w monowarstwy spolaryzowanych enterocytów.
Komórki są wysiewane na płytki z wkładkami wielokomórkowymi i tworzą konfluentną monowarstwę przez 20 dni przed eksperymentem. W dniu 20, badany związek jest dodawany do apikalnej strony membrany i strumień związku przez monowarstwę jest monitorowany w ciągu 2 godzin. Aby zbadać odpływ leku, konieczne jest również zbadanie transportu związku z przedziału podstawno-bocznego do przedziału koniuszkowego.
Współczynnik przepuszczalności (Papp) oblicza się z następującego równania:
Gdzie dQ/dt jest szybkością przenikania leku przez komórki, C0 jest stężeniem donora w czasie zerowym, a A jest obszarem monowarstwy komórkowej.
Jak interpretować dane z badania przepuszczalności Caco-2?
Istnieje kilka sposobów, w jaki można wykorzystać dane z badania przepuszczalności Caco-2. Po pierwsze, związki mogą być uszeregowane według ich wartości Papp. Dwa związki referencyjne, atenolol (pasywny transport parakomórkowy) i propranolol (pasywny transport transcelularny) są badane równolegle ze związkami badanymi. Atenolol i propranolol mają znane wchłanianie u ludzi na poziomie odpowiednio 50% i 90%2,3 i mogą być wykorzystane jako markery dla rankingu związków badanych. Po drugie, dane mogą być wykorzystane w połączeniu z innymi parametrami in vitro do przewidywania doustnej farmakokinetyki związku in vivo przy użyciu oprogramowania symulacyjnego Cloe PK. Po trzecie, dane z Caco-2 mogą być wykorzystane do przewidywania przepuszczalności bariery krew-mózg (BBB) (rysunek 3).
Korelacja pomiędzy Pactive uzyskaną z Caco-2 ((PappB-A – PappA-B)/2) a szybkością przenikania przez BBB in situ, logPS (iloczyn przepuszczalności i powierzchni). Leki, o których wiadomo, że przenikają przez BBB (kofeina, imipramina, progesteron) mają logPS >-2,0 (obszar zacieniony na zielono), podczas gdy leki, o których wiadomo, że nie przekraczają BBB (aldosteron, hydrokortyzon, cymetydyna) mają logPS ≤-3,5 (obszar zacieniony na różowo).
Przedstawiono linię regresji, która pokazuje wyraźną korelację pomiędzy Pactive i logPS dla związków, które nie podlegają znaczącym poziomom aktywności efflux w komórkach Caco-2, tj, dla związków o Pactive < 5 × 10 -6 cm/s. Wykorzystując tę korelację, test Caco-2 firmy Cyprotex może być stosowany do oceny potencjału BBB dla związków o Pactive < 5 × 10 -6 cm/s.
Jaka jest zależność pomiędzy przepuszczalnością Caco-2 a ludzką absorpcją jelitową?
Zależność pomiędzy przepuszczalnością Caco-2 (przy użyciu buforów pH7,4 HBSS w obu przedziałach apikalnych i basolateralnych) a ludzką absorpcją jelitową jest przedstawiona na rysunku 4. Korelacja ta jest typowa dla tych dwóch parametrów obserwowanych w literaturze4. Należy zauważyć, że na ten wykres ma wpływ dokładność danych dotyczących absorpcji jelitowej. Wartości absorpcji jelitowej użyte w tym wykresie pochodzą od Zhao et al. 20012. W niniejszym dokumencie dane dotyczące absorpcji jelitowej u ludzi zostały zaczerpnięte z różnych źródeł i różnią się znacznie pod względem jakości. Wiadomo również, że kilka związków wykazuje wchłanianie zależne od dawki (pokazane za pomocą słupków błędów na wykresie).
Zależność między przepuszczalnością Caco-2 a % ludzkiej absorpcji jelitowej.
Jakie są różnice między badaniem PAMPA a badaniem przepuszczalności Caco-2?
Badanie przepuszczalności Caco-2 jest uważane za bardziej reprezentatywne dla absorpcji u ludzi in vivo niż badanie PAMPA (równoległe badanie przepuszczalności sztucznych błon). PAMPA zapewnia jedynie pomiar biernej dyfuzji, podczas gdy model Caco-2 zapewnia lepsze przewidywanie wchłaniania u ludzi w przypadku związków, które wykazują aktywny wychwyt lub wypływ lub przechodzą przez błonę drogą parakomórkową. Informacje z obu badań stosowane łącznie mogą być cenne w identyfikacji pierwotnej przyczyny słabej absorpcji.
Jak zmierzyć wypływ leku?
Wykonywane jest dwukierunkowe badanie przepuszczalności Caco-2, w którym transport związku jest mierzony w kierunku od strony wierzchołkowej do podstawnej, jak również od strony podstawnej do wierzchołkowej. Wynik jest zwykle podawany jako stosunek wypływu, tj. Papp(B-A)/Papp(A-B). Jeśli stosunek efflux jest większy niż dwa, oznacza to, że występuje efflux leku. Talinolol, znany substrat P-gp, jest badany jako związek kontrolny w celu potwierdzenia, że komórki wykazują ekspresję funkcjonalnych białek transportera efflux.
Skąd wiadomo, że komórki utworzyły konfluentną monowarstwę?
Pomiar elektrycznego oporu przezbłonkowego (TEER) jest używany do określenia formowania ścisłych połączeń między komórkami. Dodatkowo, lucyfer żółty, marker integralności błony, jest współinkubowany z badanym związkiem na początku doświadczenia. Jeżeli Papp żółcieni lucyferowej przekracza 1,0 × 10 -6 cm/s w jednej studzience, ale pochodny wynik Papp dla związku badanego lub związku kontrolnego w tej studzience jest jakościowo podobny do wyniku oznaczonego w pozostałej(-ych) studzience(-kach) replikacyjnej(-ych) (w ramach progu żółcieni lucyferowej), wówczas, w oparciu o naukową ocenę odpowiedzialnego naukowca, monowarstwę komórek można uznać za możliwą do przyjęcia. Jeżeli tak nie jest, wówczas wynik z dotkniętej monowarstwy zostaje wykluczony i podaje się wynik n=1 lub związek może zostać ponownie zbadany. Jeżeli oba powtórzenia są dotknięte, związek jest ponownie badany. Jeżeli obie wartości Papp dla żółcieni lucyferowej nie powiodą się dla tego samego związku przy dwóch oddzielnych okazjach, zakłada się, że związek wykazuje albo działanie cytotoksyczne w stosunku do komórek Caco-2, albo nieodłączną fluorescencję.
Jak i dlaczego oblicza się % odzysku?
Protokół odzysku może być przydatny w interpretacji danych Caco-2. Jeżeli odzysk jest bardzo niski, może to wskazywać na problemy ze słabą rozpuszczalnością, wiązaniem związku z płytką, metabolizmem przez komórki Caco-2 lub akumulacją związku w monowarstwie komórkowej.
.
Leave a Reply