A Universal Heparin Antidote with Negligible Effect on Fibrin(ogen) and Plasma Coagulation

Background and Objective

Antykoagulanty odgrywają kluczową rolę w leczeniu zaburzeń zakrzepowo-zatorowych. Krwawienie u pacjentów chirurgicznych otrzymujących antykoagulanty jest poważnym problemem. Odtrutki są podawane w celu przeciwdziałania antykoagulacji i przywrócenia prawidłowej hemostazy. Jak dotąd siarczan protaminy (PS), kationowy polipeptyd, jest jedynym zatwierdzonym antidotum dla heparyny niefrakcjonowanej. PS ma toksyczne efekty uboczne i ograniczenia. Niezdolność PS do całkowitego odwrócenia działania heparyn drobnocząsteczkowych i fondaparynuksu wynika z jego niskiego powinowactwa do tych leków. PS wchodzi jednak w interakcje z białkami układu krzepnięcia, takimi jak fibrynogen, tworząc agregaty, co prowadzi do niekorzystnych skutków sercowo-naczyniowych. Niedawno opracowaliśmy syntetyczny uniwersalny heparynowy czynnik odwracający działanie heparyn (UHRA) o wysokim powinowactwie wiązania z heparynami. Badania in vivo wykazały, że UHRA całkowicie odwraca działanie wszystkich dostępnych klinicznie antykoagulantów parenteralnych i jest nietoksyczny. Niniejsze badanie ma na celu wykazanie nietoksyczności UHRA poprzez ocenę jego wpływu na fibrynogen, architekturę skrzepu fibrynowego, krzepnięcie osocza i lizę skrzepu.

Metody

UHRA został opracowany poprzez włączenie grup wiążących heparynę opartych na aminach trzeciorzędowych do dendrytycznego, hiperrozgałęzionego rusztowania poliglicerolowego i zamknięcie go łańcuchami metoksy glikolu polietylenowego. W celu poznania wpływu UHRA na układ krzepnięcia przeprowadzono testy odwapniania oraz inicjowane czynnikiem tkankowym (TF) turbidymetryczne testy krzepnięcia osocza. Interakcję UHRA z fibrynogenem badano za pomocą testu agregacji fibrynogenu, testu polimeryzacji fibryny oraz analizy spektroskopowej (fluorescencji i dichroizmu kołowego (CD)). Wpływ UHRA na architekturę skrzepów fibryny oceniano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Neutralizację antykoagulantów (heparyn) przez UHRA badano za pomocą fluorogenicznego testu generacji trombiny (TGA) w ludzkim osoczu bogatopłytkowym (PRP). Liza indukowanego TF skrzepu osocza zawierającego UHRA lub PS poddanego działaniu egzogennego tkankowego aktywatora plazminogenu (t-PA) była badana testem turbidymetrycznym.

Wyniki i dyskusja

Wyniki testów krzepnięcia osocza wykazały, że UHRA nie zmieniała parametrów krzepnięcia w porównaniu z PS (czas opóźnienia inicjacji TF i maksymalna absorbancja, kontrola vs UHRA 200 mcg/mL, p=0.21 i 0,16, odpowiednio; czas opóźnienia i maksymalna absorbancja w rekowalcyfikacji, kontrola vs UHRA 200 mcg/mL, p=0,08 i 0,13, odpowiednio) sugerując, że UHRA nie ma wpływu na układ krzepnięcia w badanym stężeniu (Rysunek 1). W przeciwieństwie do protaminy, test agregacji fibrynogenu i polimeryzacji fibryny nie był pod wpływem UHRA w szerokim zakresie stężeń od 0,05mg/mL do 1mg/mL. Wraz z pomiarami wygaszania fluorescencji tryptofanu (Rysunek 2) i pomiarami struktury drugorzędowej fibrynogenu potwierdzają, że UHRA nie oddziałuje z fibrynogenem. Wyniki te są zupełnie inne niż w przypadku PS i innych syntetycznych polimerów kationowych, które oddziałują z fibrynogenem wywołując agregację i zmiany konformacyjne. Skrzepy fibrynowe generowane w obecności UHRA (nawet w stężeniu 0,5 mg/mL) wykazywały podobną strukturę, a rozmiar włókien pozostawał taki sam jak w przypadku normalnego skrzepu fibrynowego (kontrola vs skrzep UHRA 0,5 mg/mL, p= 0,12) (ryc. 3). Z drugiej strony, skrzepy fibryny utworzone w obecności 0,05mg/mL PS (dawka kliniczna) zwiększyły rozmiar włókien i zmieniły strukturę skrzepu dramatycznie (kontrola vs skrzep PS 0,05mg/mL, p< 0,0001). Nasze badania lizy skrzepu osocza w obecności egzogennego t-PA pokazują, że UHRA nie zwiększała degradacji skrzepu w przeciwieństwie do protaminy. UHRA przywróciła poziom trombiny w antykoagulowanym PRP (heparynizowanym), wykazując skuteczność.

Wnioski i znaczenie

Nasze badania wykazują, że uniwersalne antidotum heparynowe, UHRA, ma znikomy wpływ na fibrynogen, polimeryzację fibryny, strukturę skrzepu, degradację skrzepu i układ krzepnięcia, ujawniając ich doskonałą hemokompatybilność w porównaniu z protaminą. Nasze wyniki potwierdzają fakt, że UHRA może być idealnym antidotum do przywracania hemostazy po inwazyjnych zabiegach chirurgicznych oraz do zwalczania powikłań krwotocznych po antykoagulantach opartych na heparynie.

Brak istotnych konfliktów interesów do zgłoszenia.