Pilzdimorphismus und Virulenz: Molekulare Mechanismen für Temperaturanpassung, Immunumgehung und In-vivo-Überleben

Abstract

Die thermisch dimorphen Pilze sind eine einzigartige Gruppe von Pilzen innerhalb des Ascomycota-Stamms, die auf Temperaturveränderungen reagieren, indem sie sich zwischen Hyphen (22-25°C) und Hefe (37°C) umwandeln. Dieser morphologische Wechsel, der als Phasenübergang bezeichnet wird, bestimmt die Biologie und Lebensweise dieser Pilze. Die Umwandlung in Hefe in gesunden und immungeschwächten Säugetierwirten ist entscheidend für die Virulenz. In der Hefephase regulieren die thermisch dimorphen Pilze Gene hoch, die an der Unterwanderung der Immunabwehr des Wirts beteiligt sind. Diese Übersicht beleuchtet die molekularen Mechanismen, die den Phasenübergang steuern, und die jüngsten Fortschritte bei der Frage, wie der Phasenübergang die Infektion fördert.

1. Einleitung

Die Fähigkeit von Pilzen, zwischen verschiedenen morphologischen Formen zu wechseln, ist im gesamten Pilzreich weit verbreitet und ein grundlegender Bestandteil ihrer Biologie. Eine kleine Untergruppe von Pilzen innerhalb des Stammes der Ascomycota gilt als dimorph, was sich auf die Fähigkeit bezieht, zwischen zwei spezifischen morphologischen Formen, Hefe und Hyphen, zu wechseln. Diese Pilze sind in der Lage, Säugetiere, Pflanzen und Insekten zu infizieren, und können in thermische und nichtthermische dimorphe Pilze unterteilt werden. Thermisch dimorphe Pilze infizieren Menschen und andere Säugetiere wie Hunde, Katzen, Gürteltiere und Nagetiere (Tabelle 1). Die thermisch dimorphen Pilze sind einzigartig unter den Pilzpathogenen, da sie Menschen mit normaler und geschwächter Immunabwehr infizieren können. Dazu gehören die Erreger von Blastomykose, Histoplasmose, Kokzidioidomykose, Parakokzidioidomykose und Sporotrichose. Im Gegensatz dazu treten Penicilliose und Emmonsiose bei Personen mit langjähriger HIV-Infektion auf, die zu AIDS fortgeschritten ist (CD4+ T-Zellen/mm3) oder bei denen die zellvermittelte Immunität aus anderen Gründen beeinträchtigt ist (z. B. nach einer Transplantation fester Organe). Nichtthermische dimorphe Pilze können ebenfalls Infektionen beim Menschen verursachen (z. B. Malassezia furfur), sind aber in der Regel eher phytopathogen oder entomopathogen. So hat beispielsweise Ophiostoma novo-ulmi, der Erreger der Holländischen Ulmenkrankheit, Millionen von Ulmen in Europa und den Vereinigten Staaten vernichtet. Der „Zombieameisen“-Pilz Ophiocordyceps unilateralis sondert Stoffwechselprodukte ab, die das Verhalten der infizierten Ameisen verändern. Diese Übersicht wird sich darauf konzentrieren, wie der morphologische Wechsel zwischen Hyphen und Hefe zur Virulenz beiträgt, wobei der Schwerpunkt auf thermisch dimorphen Pilzen liegt, die für die menschliche Gesundheit relevant sind.

2. Der Phasenübergang

Der reversible morphologische Übergang zwischen Hyphen und Hefe, der als Phasenübergang bezeichnet wird, ist ein grundlegendes Merkmal der Biologie und Lebensweise der dimorphen Pilze. Im Boden (22-25°C) wachsen diese Pilze als septierte Hyphen, die Konidien produzieren. Bei Störungen des Bodens durch menschliche Aktivitäten wie Bauarbeiten oder Naturkatastrophen können Konidien und Hyphenfragmente aerosoliert werden. Beim Einatmen in die warme Lunge eines Säugetierwirts (37 °C) wandeln sich diese infektiösen Keime in pathogene Hefen (oder Sphärien bei Coccidioides) um und verursachen eine Lungenentzündung. Sobald sich die Infektion in der Lunge etabliert hat, können sich die Hefepilze (oder Sphärolithen) auf andere Organe wie die Haut, die Knochen oder das Gehirn ausbreiten.

Obwohl die Temperatur der vorherrschende Stimulus ist, der den Phasenübergang beeinflusst – Hyphen bei 22-25°C und Hefepilze bei 37°C -, gehören zu den zusätzlichen Stimuli, die sich auf den dimorphen Wechsel auswirken, die Kohlendioxid (CO2)-Spannung, exogenes Cystein und Estradiol. Eine erhöhte CO2-Spannung (5 % CO2) ist erforderlich, damit die Arthrokonidien von Coccidioides spp. bei 37 °C zu Sphärolithen auskeimen können und für das optionale Wachstum von Histoplasma capsulatum-Hefen. In der menschlichen Lunge ist die CO2-Spannung etwa 150-mal höher als in der Umgebungsluft, was eine optimale CO2-Menge für den Phasenübergang darstellt. Als Reaktion auf einen Temperaturanstieg wird die mitochondriale Atmung bei Histoplasma, Blastomyces und Paracoccidioides eingestellt. Um die Atmung zu reaktivieren und die morphologische Umstellung auf Hefe abzuschließen, ist die Aufnahme von exogenem Cystein erforderlich. Die Produktion von 17β-Östradiol durch den Menschen beeinflusst die morphologische Veränderung und das Wachstum von Coccidioides und Paracoccidioides, was wiederum den Schweregrad der Infektion bei Frauen moduliert. In Gegenwart von 17β-Östradiol wird das Wachstum von Coccidioides-Kügelchen bei 37°C beschleunigt, was das erhöhte Risiko einer disseminierten Coccidioidomykose bei schwangeren Frauen erklären könnte. Darüber hinaus haben In-vitro-Analysen gezeigt, dass Coccidioides-Kügelchen eine sättigbare Bindung von 17β-Östradiol aufweisen. Im Gegensatz zu Coccidioides wird der morphologische Wechsel von Hyphen oder Konidien zu Hefe bei Paracoccidioides durch 17β-Östradiol blockiert. In einem Mausmodell der Lungeninfektion ist die Umwandlung von Konidien in Hefe bei weiblichen, aber nicht bei männlichen Mäusen beeinträchtigt. Beim Menschen ist die Inzidenz der Paracoccidioidomykose bei erwachsenen Männern 11-30-mal höher als bei erwachsenen Frauen, obwohl die Häufigkeit der Paracoccidioides-Exposition ähnlich ist. Vor der Pubertät ist das Verhältnis von Männchen zu Weibchen 1 : 1.

Diese Beobachtungen haben zur Untersuchung der Mechanismen geführt, durch die Östradiol und Geschlecht die Pilzentwicklung und die Wirtsreaktion beeinflussen. Eine Genexpressions-Mikroarray-Analyse des P. brasiliensis-Stammes Pb01 zeigte, dass eine gestörte Umwandlung in Hefe bei 37°C in Gegenwart von 17β-Östradiol die Transkription von Genen reduzierte, die an der Zellsignalisierung (kleine GTPase RhoA, Palmitoyltransferase), dem Hitzeschock (HSP40, HSP70 und HSP90), der Chitinsynthese (Chitinsynthase) und dem Glucanumbau (β-1,3-Glucansynthase, α-1,3-Glucansynthase) beteiligt sind. Wenn weibliche Mäuse mit Paracoccin, einem Lektin-bindenden Protein mit Chitinase-Aktivität, stimuliert werden, zeigen sie im Vergleich zu männlichen Mäusen eine stärkere Th1-Zytokin-Antwort mit erhöhter Produktion von Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α), Interferon gamma (INF-γ) und Interleukin 12 (IL-12) sowie eine erhöhte fungizide Aktivität der Makrophagen. Nach Oophorektomie und Behandlung mit Testosteron verschob sich die Zytokinreaktion bei weiblichen Mäusen von Th1 zu Th2. Die Kastration männlicher Mäuse in Verbindung mit einer Östradioltherapie begünstigte eine Th1-Zytokinreaktion anstelle einer Th2-Zytokinreaktion. Insgesamt unterstreichen diese Ergebnisse die Bedeutung der Geschlechtshormone und des Geschlechts für die Entwicklung von Pilzen und die Anfälligkeit des Wirts.

3. Virulenzfaktoren der Hefephase und Unterwanderung der Immunabwehr des Wirts

Nach dem Einatmen in die Lunge werden die Konidien von Makrophagen aufgenommen, wo sie zu Hefepilzen (oder Sphärolithen bei Coccidioides) auskeimen und sich vermehren. Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis und posadasii, Sporothrix schenckii, Paracoccidioides brasiliensis und lutzii sowie Talaromyces marneffei vermehren sich innerhalb und außerhalb von Zellen des angeborenen Immunsystems. Traditionell wurde angenommen, dass Blastomyces spp. ausschließlich extrazellulär vorkommen; neuere Forschungen zeigen jedoch, dass B. dermatitidis-Konidien, die von Makrophagen aufgenommen werden, überleben und sich in Hefe umwandeln .

Während des Phasenübergangs regulieren die thermisch dimorphen Pilze hefephasenspezifische Gene hoch, darunter Blastomyces adhesion-1 (BAD-1), calcium-binding protein-1 (CBP1), yeast-phase specific-3 (YPS3) und spherule outer wall glycoprotein (SOWgp), um die Immunabwehr des Wirts aktiv zu unterlaufen. B. dermatitidis und B. gilchristii exprimieren BAD1 (früher WI-1), ein 120 kDA großes, sekretiertes, multifunktionales Protein, das als Adhäsions- und Immunevasin dient. Sekretiertes BAD1 bindet über Wechselwirkungen mit Chitin an die Hefezelloberfläche zurück und bleibt auch im extrazellulären Milieu löslich. Das an die Zelloberfläche gebundene BAD1 bindet die Hefe über Komplementrezeptoren (CR3, CD14) und Heparansulfat an die Wirtszellen und fördert so die Adhäsion der Hefezellen an die Wirtszellen. An die Hefezelloberfläche gebundenes BAD-1 hemmt die Produktion von TNF-α durch Makrophagen und Neutrophile in einer vom transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β) abhängigen Weise. Im Gegensatz dazu blockiert lösliches BAD-1 die TNF-α-Produktion unabhängig von TGF-β. TNF-α ist ein kritisches Zytokin für eine angemessene Wirtsabwehr gegen die dimorphen Pilze. Die Neutralisierung von TNF-α in einem Infektionsmodell bei Mäusen führt zu einer progressiven pulmonalen Blastomykose. Darüber hinaus warnte die Food and Drug Administration (FDA) im Jahr 2008 vor einem erhöhten Risiko für Histoplasmose, Blastomykose und Kokzidioidomykose bei Personen, die TNF-α-Hemmer zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen (z. B. rheumatoide Arthritis und Morbus Crohn) einnehmen. Neben der Beeinträchtigung der TNF-α-Produktion beeinträchtigt BAD1 auch die adaptive Immunantwort, indem es die Aktivierung von CD4+ T-Lymphozyten hemmt, wodurch die Produktion von IL-17 und INF-γ sinkt. Die Adhäsions- und immunmodulatorischen Aktivitäten von BAD1 sind für die Pathogenese von Blastomyces wesentlich. Die Deletion von BAD1 führt dazu, dass Blastomyces-Hefen in einem Mausmodell für Lungeninfektionen avirulent werden. Zusätzlich zu BAD1 sondert Blastomyces dermatitidis eine Dipeptidyl-Peptidase IVA (DppIVA) ab, um die Immunität des Wirtes zu beeinflussen. DppIV ist eine Serinprotease, die GM-CSF spaltet, ein starkes Zytokin, das Makrophagen und Neutrophile zur Abtötung von Pilzen aktiviert. Die Ausschaltung von DppIVA durch RNA-Interferenz (RNAi) verringert das Überleben von B. dermatitidis-Hefen in Kokultur mit GM-CSF-aktivierten Makrophagen und Neutrophilen. Darüber hinaus haben DppIVA-RNAi-Stämme eine abgeschwächte Virulenz während einer Lungeninfektion. Im Gegensatz zu B. dermatitidis wird H. capsulatum DppIVA nicht extrazellulär nachgewiesen und trägt nicht zur Virulenz bei.

Analog zu BAD1 ist Coccidioides SOWgp auf der Sphäro-Zelloberfläche lokalisiert und ein wichtiger Virulenzfaktor. SOWgp erleichtert die Bindung von Sphäroliven an Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) des Wirts, darunter Laminin, Fibronektin und Kollagen. Die Deletion von SOWgp (SOWgp∆) in Coccidioides beeinträchtigt die Bindung der Sphärolithen an ECM-Proteine und führt zu einer abgeschwächten Virulenz in einem Mausmodell für Lungeninfektionen.

In H. capsulatum ist CBP1 ein sekretierter Virulenzfaktor, der die intrazelluläre Replikation der Hefe fördert. CBP1 bindet Kalzium, liegt als Homodimer vor, ist resistent gegen den Abbau durch Proteasen und ist strukturell mit einer Gruppe von membranlipidbindenden Proteinen verwandt, die als Saposine bekannt sind. CBP1, das von der intrazellulären H. capsulatum-Hefe sezerniert wird, induziert Makrophagen-Apoptose und -Lyse, indem es die Transkription von Wirtszell-Caspasen, Transkriptionsfaktoren (NUPR1/p8, TRB3) und Genen induziert, die am Stress des endoplasmatischen Retikulums (ER) beteiligt sind. Die Makrophagen-Lyse ist also ein aktiver, vom Pilz gesteuerter Prozess und nicht auf eine hohe intrazelluläre Pilzbelastung zurückzuführen. Ähnlich wie BAD1 ist auch CBP1 ein wesentlicher Virulenzfaktor. CBP1-Nullmutanten (CBP1Δ) sind nicht in der Lage, Makrophagen-Apoptose auszulösen, und sind im Mausmodell der Lungeninfektion avirulent. Zusätzlich zu CBP1 sondert H. capsulatum YPS3 ab, das sich wieder an Chitin in der Hefezellwand bindet und die extrapulmonale Verbreitung in Leber und Milz erleichtert.

Während des morphologischen Wechsels von Hyphen zu Hefe oder Konidien zu Hefe durchlaufen dimorphe Pilze einen umfassenden Umbau der Zellwand, einschließlich der Glucanzusammensetzung. Die Umstrukturierung des Glucangehalts kann die Erkennung von pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMPs) durch Immunzellen des Wirtes behindern. Während des morphologischen Wechsels sinkt die Menge an β-(1,3)-Glucan in der Zellwand von Blastomyces und Paracoccidioides von ≈40% in Hyphen auf ≈5% in Hefe. Die Verringerung des β-(1,3)-Glucans in der Hefezellwand kann seine Erkennung durch Dectin-1 auf angeborenen Immunzellen und Mannose-bindende Lektine einschränken. Im Gegensatz dazu reduziert H. capsulatum das β-(1,3)-Glucan in Hefezellen nicht, sondern verwendet α-(1,3)-Glucan als „Schutzschild“, um die Erkennung von β-(1,3)-Glucan durch Dectin-1 zu blockieren. Somit nutzen die dimorphen Pilze mehrere Strategien, einschließlich sekretierter Virulenzfaktoren und Modifikationen der Hefezellwand, um die Immunabwehr des Wirts zu unterlaufen und eine Infektion auch bei Personen mit intaktem Immunsystem zu etablieren.

Die Fähigkeit der thermisch dimorphen Pilze, die Immunabwehr des Wirts zu unterlaufen, ist nicht zu 100 % wirksam. Der Wirt kann eine Immunreaktion auslösen, um das Fortschreiten der Infektion aufzuhalten. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass ≈50 % der Personen, die Blastomyces spp. ausgesetzt sind, eine symptomatische Infektion entwickeln, während ≈50 % eine asymptomatische oder subklinische Infektion haben. In ähnlicher Weise führt die Inhalation von Histoplasma capsulatum, Coccidioides spp. und Paracoccidioides spp. bei <10 %, 33-50 % bzw. <5 % der gesunden Personen zu einer symptomatischen Infektion. Eine intakte angeborene und adaptive Immunabwehr sowie die Fähigkeit, Hefepilze in Granulomen „einzumauern“, sind entscheidend für die Abwehr der Infektion durch den Wirt. Nach der Umwandlung der Konidien in Hefe interagieren dendritische Zellen und Makrophagen mit den Hefezellen und verschlingen sie. Genexpressionsanalysen von dendritischen Zellen, die P. brasiliensis-Hefe phagozytiert haben, zeigten eine Hochregulierung von Transkripten, die an der Erzeugung einer schützenden Immunantwort beteiligt sind, darunter TNF-α, IL-12 und Chemokine (CCL22, CCL27 und CXCL10). Darüber hinaus wurde der Dectin-1-Rezeptor hochreguliert, der als Reaktion auf die Bindung von β-(1,3)-Glucan die Phagozytose, die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies sowie proinflammatorische Zytokine und Chemokine induziert. Chemokine fördern die Migration von Leukozyten zum Infektionsherd. In ähnlicher Weise induzieren mit P. brasiliensis infizierte Makrophagen eine proinflammatorische Reaktion mit einer Hochregulierung von TNF-α, Chemokinen (CCL21, CCL22, CXCL4, CXC11 und CXCL14) und Kinasen (IRAK2). Diese Ergebnisse unterstreichen die Fähigkeit der Immunabwehr, die Auswirkungen von Pilzvirulenzfaktoren zu begrenzen.

4. Regulierung des Phasenübergangs

Der Übergang von Hyphen oder Konidien zu Hefe bei 37°C ist für die Virulenz entscheidend. Die Entdeckung einer hybriden Histidin-Kinase, die von DRK1 in Blastomyces und Histoplasma kodiert wird, lieferte den ersten genetischen Beweis dafür, dass der morphologische Übergang zur Hefe direkt mit der Virulenz verbunden ist. DRK1-Null- (DRK1Δ), Insertionsmutanten und RNA-Interferenz- (RNAi-) stillgelegte Stämme wachsen bei 37 °C als Hyphen anstelle von Hefe, regulieren keine hefephasenspezifischen Virulenzfaktoren wie BAD1 und CBP1 hoch und sind in einem Infektionsmodell für Mäuse avirulent. Die Funktion von DRK1 ist bei den thermisch dimorphen Pilzen konserviert. In T. marneffei ist DRKA (ein DRK1-Homolog) entscheidend für die Umwandlung von Konidien in Hefe in Makrophagen. Bei Sporothrix, Paracoccidioides und T. marneffei ist die Transkriptionshäufigkeit von DRK1 in Hefe (37°C) höher als in Hyphen (25°C). Es wird angenommen, dass DRK1 als Teil der Signalkaskade für hochosmolares Glycerin (HOG) fungiert, die die Anpassung an osmotischen, oxidativen und Temperaturstress erleichtert. Dementsprechend wird die DRK1-Transkription auch als Reaktion auf osmotischen Stress in Paracoccidioides und T. marneffei hochreguliert. DRK1 erleichtert nicht nur die Anpassung an Temperatur- und osmotischen Stress, sondern beeinflusst auch die Integrität der Zellwand.

Die Regulierung der morphologischen Veränderung ist komplex und nicht auf DRK1 beschränkt. Die von RYP1-4 kodierten Transkriptionsfaktoren (die für die Hefephase erforderlich sind) steuern ebenfalls den Phasenübergang und regulieren eine Reihe von Hefephasen-spezifischen Genen, die an der Virulenz bei 37°C beteiligt sind. Diese Transkriptionsfaktoren werden bei 37°C hochreguliert und sind bei dimorphen und filamentösen Pilzen konserviert. RYP1 ist ein Homolog des Hauptreglers WOR1 in C. albicans, während RYP2 und RYP3 Teil des Velvet-Komplexes, VosA bzw. VelB, sind. RYP4 ist ein Zn(II)2Cys6-Protein mit binuklearer Zinkcluster-Domäne, das homolog zu A. nidulans FacB ist; es scheint jedoch nicht an der Acetatverwertung beteiligt zu sein. Diese Transkriptionsfaktoren bilden ein integriertes Netzwerk, in dem sie eine Reihe von Kerngenen direkt binden und regulieren, darunter solche, die für die Virulenz wichtig sind, wie CBP1 und YPS3 . Die Unterdrückung der RYP1-4-Transkription führt dazu, dass die Zellen den Phasenübergang nicht ordnungsgemäß durchlaufen und bei 37 °C als Hyphen wachsen.

Der morphologische Wechsel in die entgegengesetzte Richtung, von Hefe zu Hyphen, ist ebenfalls wichtig für die Pathogenese. Das Wachstum als Hyphen fördert das Überleben in der Umwelt, die Erzeugung von Konidien zur Erleichterung der Übertragung auf neue Wirte und die genetische Vielfalt durch Paarung. B. dermatitidis SREB und H. capsulatum SRE1 kodieren für einen GATA-Transkriptionsfaktor, der den Übergang zu Hyphen nach einem Temperaturabfall von 37°C auf 22-25°C steuert. SREB-Nullmutanten (SREBΔ) und SRE1-RNAi-Stämme können die Umwandlung in Hyphen nicht abschließen. Die Rolle dieses GATA-Transkriptionsfaktors bei der Temperaturanpassung ist auch bei anderen Pilzen bekannt. Ein Homolog von SREB und SRE1 in C. neoformans, CIR1, ist für die Thermotoleranz bei 37 °C wesentlich. Bei B. dermatitidis entspricht der Defekt in der morphologischen Umschaltung einer Abnahme der Biosynthese von neutralen Lipiden (Ergosterol, Triacylglycerol) und Lipidtröpfchen. Eine Supplementierung mit exogenen gesättigten Fettsäuren (Palmitinsäure, 16 : 0, und Stearinsäure, 18 : 0) korrigierte teilweise die Defekte in der Morphogenese und der Lipidtröpfchenbildung. Dies deutet darauf hin, dass der neutrale Lipidstoffwechsel möglicherweise den Phasenübergang zu Hyphen bei Umgebungstemperatur beeinflussen muss. SREB und SRE1 wirken auch als negative Regulatoren von Genen, die an der Siderophor-Biosynthese und der Eisenaufnahme beteiligt sind; diese Rolle scheint jedoch unabhängig vom Phasenübergang zu sein. Bei H. capsulatum führt die Deletion von VMA1, das für eine vakuoläre ATPase kodiert, die an der intrazellulären Eisenhomöostase beteiligt ist, zu Zellen, die sich bei 25 °C nicht in Hyphen verwandeln. Dies deutet darauf hin, dass der Eisenstoffwechsel, der nicht durch SREB reguliert wird, den temperaturabhängigen morphologischen Wechsel beeinflussen kann. In T. marneffei wird die Umwandlung in Hyphen und die Aufrechterhaltung der filamentösen Morphologie bei 25 °C durch Transkriptionsfaktoren gesteuert, die von HGRA bzw. TUPA kodiert werden. Zusätzlich zu den Transkriptionsregulatoren beschleunigt N-Acetylglucosamin (GlcNAc) die Umwandlung von Hefe in Hyphen in B. dermatitidis und H. capsulatum über die Transmembrantransporter NGT1 und NGT2.

5. In-vivo-Transkriptions-Profiling

Die Anwendung vorwärtsgenetischer Strategien wie Insertionsmutagenese hat das Gebiet der medizinischen Mykologie in Bezug auf die thermisch dimorphen Pilze erheblich vorangebracht. Dies hat zur Entdeckung neuer Gene und Gennetzwerke geführt, die den Phasenübergang regulieren (z. B. DRK1, RYP1-3 und SREB). Im Zeitalter der genomweiten Assoziationsstudien ist die Erstellung von Transkriptionsprofilen von Hefe während der Infektion ein ungenutztes Reservoir für die Entdeckung neuer Gene oder Gennetzwerke in dimorphen Pilzen. Zur Identifizierung von Genen, die für die Pathogenität wichtig sind, wurde für den Blastomyces dermatitidis-Stamm 26199 ein in vivo-Transkriptionsprofil in einem Lungeninfektionsmodell für Mäuse erstellt. Es wurde ein neuartiges, zweistufiges Verfahren zur effizienten Abtrennung von B. dermatitidis-Hefen aus Lungengewebe von Mäusen entwickelt, um qualitativ hochwertige RNA für die RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) zu erhalten. Zur Identifizierung von B. dermatitidis-Genen mit veränderter Transkription unabhängig von der Temperatur oder anderen Bedingungen wurde das Transkriptionsprofil von aus Mäuselungen isolierten Hefen mit Hefen verglichen, die mit Makrophagen bei 37 °C kokultiviert wurden, mit Hefen, die in vitro ohne Makrophagen aus dem Knochenmark bei 37 °C gezüchtet wurden, und mit Hyphen bei 22 °C unter Verwendung einer K-Mittelwert-Clusteranalyse. Bei dieser Analyse wurden 72 Gene identifiziert, die in vivo >2-fach hochreguliert wurden und unabhängig von Temperatur, Makrophagen-Kokultur und Medienbedingungen waren. Eine Untergruppe dieser Gene umfasste solche, die für Proteine kodieren, die in das extrazelluläre Milieu sezerniert werden, für die Aufnahme und den Transport von Metallkationen und für den Aminosäurestoffwechsel.

Gene, die mit dem Erwerb von Zink zu tun haben, werden von B. dermatitidis-Hefen während der Lungeninfektion hochreguliert. Dazu gehören ein Zinkophor (PRA1/ZPS1), ein hochaffiner Zink-Transporter (ZRT1) und ein Zink-Transporter mit niedriger Affinität (ZRT2). In Candida albicans wird PRA1 in die extrazelluläre Umgebung sezerniert, um Zink zu binden und es über seine Wechselwirkung mit ZRT1 an der Zelloberfläche an den Pilz abzugeben. Bei C. albicans, Aspergillus fumigatus und Ustilago maydis sind PRA1 und ZRT koreguliert und syntenisch. Obwohl PRA1 und ZRT1 in Blastomyces koreguliert zu sein scheinen, sind diese Gene nicht syntenisch. Überraschenderweise ist PRA1 unter den dimorphen Pilzen nicht gut konserviert und fehlt in den Genomen von H. capsulatum, Paracoccidioides spp. und Emmonsia; Homologe sind jedoch in Coccidioides vorhanden. Bei C. albicans wird angenommen, dass PRA1 die Pathogenese beeinflusst. Die Deletion von PRA1 führt zu Mutanten, die unter zinkarmen Bedingungen eine verminderte Fähigkeit zur Lyse von Endothelzellen aufweisen. Die Auswirkung von PRA1 während einer In-vivo-Infektion wurde noch nicht untersucht.

Zusätzlich zur Hochregulierung von Zink-Fangmechanismen in vivo erhöht B. dermatitidis die Transkription von NIC1, das für einen Nickeltransporter kodiert. Nickel ist für die ordnungsgemäße Funktion von Urease erforderlich, einem Enzym, das die Umwandlung von Harnstoff in Ammoniak und CO2 katalysiert. Harnstoff kommt in Säugetiergeweben als Produkt des Purinnukleotidabbaus vor. In Coccidioides wird die Urease während der Replikation aus den Sphärolithen freigesetzt und schädigt das Gewebe durch die Produktion von Ammoniak, das die Mikroumgebung alkalisiert. Die Deletion des Urease-Gens (UREΔ) in C. posadasii führt zu einer abgeschwächten Virulenz im Mausmodell der Lungeninfektion. An den Orten der Lungeninfektion sind die UREΔ-Zellen nicht in der Lage, Harnstoff im Lungengewebe abzubauen und den pH-Wert zu senken (Gewebe-pH-Wert 7,2 bei UREΔ gegenüber pH-Wert 7,7 beim Wildtyp). Darüber hinaus zeigten Mäuse, die mit der Null-Mutante infiziert waren, eine besser organisierte Immunreaktion mit gut ausgebildeten Granulomen, die UREΔ-Zellen umschlossen. Bei Cryptococcus neoformans tragen NIC1 und URE1 zur Invasion des Gehirns bei. Die Deletion eines der beiden Gene führt zu einer verminderten Fähigkeit der NIC1Δ- und URE1Δ-Hefezellen, in das zentrale Nervensystem einzudringen. URE1 trägt auch zur Pathogenese von Cryptococcus gattii bei, der in erster Linie Lungeninfektionen verursacht, ohne dass in Tiermodellen eine erhöhte Neigung zur Invasion des ZNS zu beobachten ist. C. gattii URE1Δ hat eine abgeschwächte Virulenz während der Lungeninfektion, eine geringere Fähigkeit zur Verbreitung in den Blutkreislauf und eine beeinträchtigte intrazelluläre Replikation in Makrophagen.

Während der Lungeninfektion reguliert B. dermatitidis Dioxygenasen hoch, die am Katabolismus von Aminosäuren beteiligt sind. Dazu gehören 4-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (4-HPPD, HpdA), Homogentisat-1,2-Dioxygenase (HmgA), Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) und Cystein-Dioxygenase (CDG). HpdA und HmgA sind unter den dimorphen Pilzen konserviert und in einem Gencluster lokalisiert. Obwohl die genaue Rolle von HpdA und HmgA bei B. dermatitidis nicht bekannt ist, hat die Forschung an T. marneffei gezeigt, wie diese am Tyrosinkatabolismus beteiligten Gene die Pathogenese beeinflussen. HpdA- und HmgA-Nullmutanten sind überempfindlich gegenüber oxidativem Stress und haben eine beeinträchtigte Sporenauskeimung auf Hefe in murinen und menschlichen Makrophagen. Die Hemmung der 4-HPPD-Aktivität scheint für die temperaturabhängige morphologische Veränderung von Bedeutung zu sein. Die chemische Hemmung von 4-HPPD durch NTBC (2-(2-Nitro-4-trifluormethylbenzoyl)-cyclohexan-1,3-dion) in T. marneffei und P. brasiliensis blockiert die Umwandlung von Konidien oder Hyphen in Hefe nach einer Temperaturerhöhung von 25°C auf 37°C .

Die Rolle der pilzlichen IDO beim Abbau von Tryptophan ist nur unzureichend geklärt; Tumorzellen regulieren jedoch IDO hoch, um Tryptophan in der Mikroumgebung abzubauen und so den Immunzellen des Wirts zu entgehen. Eine Lungeninfektion mit H. capsulatum und P. brasiliensis induziert die IDO des Wirts, die das Pilzwachstum reduziert, die Differenzierung von Th17-T-Lymphozyten hemmt und übermäßige Gewebeentzündungen begrenzt.

Neben der Cystein-Dioxygenase (CDG) reguliert B. dermatitidis während der Lungeninfektion die Cystein-Synthase A (CSA) und eine Sulfit-Efflux-Pumpe (SSU1) hoch. CSA kodiert für ein Enzym, das an der Biosynthese von L-Cystein aus Acetyl-L-Serin beteiligt ist. CDG spaltet L-Cystein zu L-Cysteinsulfonsäure ab, die weiter zu Pyruvat und Sulfit abgebaut werden kann. Das anfallende Sulfit ist potenziell zelltoxisch und wird über eine von SSU1 kodierte Effluxpumpe ausgeschieden. Bei C. albicans beeinträchtigt die Deletion von CDG1 und SSU1 die Hyphenentwicklung in Gegenwart von Cystein und CDG1Δ, aber nicht SSU1Δ, und verringert die Virulenz während der Infektion von Mäusen. Es wird angenommen, dass bei Dermatophyten wie Arthroderma benhamiae der Abbau von Cystein zu Sulfit durch CDO1 und der anschließende Ausfluss von Sulfit in die extrazelluläre Umgebung durch SSU1 den Abbau von Keratin fördert, um das Pilzwachstum zu erleichtern. CDO1- und SSU1-Null-Mutanten von A. benhamiae haben eine beeinträchtigte Fähigkeit, auf keratinreichen Substraten wie Haaren und Nägeln zu wachsen. Auf der Grundlage dieser Daten besteht die Möglichkeit, dass der Abbau von Cystein und die Sekretion von Sulfit das Wachstum von Blastomyces-Hefen in der Haut fördern könnte, die reich an Keratin ist und der häufigste Ort für die extrapulmonale Verbreitung ist.

6. Schlussfolgerungen

Die thermisch dimorphen Pilze sind eine einzigartige Gruppe von Ascomyceten, die in der Lage sind, Personen mit intakter und geschwächter Immunabwehr zu infizieren. Ihre Fähigkeit, sich an die Körperkerntemperatur (37°C) anzupassen und sich in eine Hefemorphologie umzuwandeln, ist für die Virulenz entscheidend. Die Umstellung auf die Hefemorphologie geht mit der Hochregulierung spezifischer Virulenzfaktoren einher, die die Adhäsion an das Wirtsgewebe, das Wachstum in und die Lyse von Makrophagen fördern, angemessene Zytokinreaktionen abstumpfen und die zellvermittelte Immunität beeinträchtigen. Die Regulierung des reversiblen Übergangs zwischen Hyphen und Hefe erfordert, dass sich diese Pilze anpassen und auf zahlreiche Stimuli wie Temperatur, CO2-Spannung und Sexualhormone reagieren. Die In-vivo-Transkriptionsprofilierung hat begonnen, bisher unerkannte Gene aufzudecken, die für die Vermehrung und Virulenz im Säugetierwirt wichtig sind.

Interessenkonflikte

Der Autor erklärt, dass er keine Interessenkonflikte hat.