Articles /

U.S. Food and Drug Administration

Bacteriological Analytical Manual (BAM) Main Page

Authors: Sandra M. Tallent, Reginald W. Bennett en Jennifer M. Hait

Revisiegeschiedenis:

  • Juni 2017 – Nieuw hoofdstuk 13B werd toegevoegd aan het Bacteriologisch Analytisch Handboek
  • Januari 2018 – Hyperlink voor CDC APHIS/CDC Formulier 4 gecorrigeerd

Staphylococcen voedselvergiftiging (SFP) is een intoxicatie die het gevolg is van de consumptie van voedsel dat is besmet met voldoende niveaus van voorgevormde enterotoxinen. Symptomen van SFP manifesteren zich binnen 2-8 uur na inname en omvatten misselijkheid, braken, buikkrampen met of zonder diarree die gewoonlijk binnen 24-48 uur verdwijnen. (Argudin et al., 2010). Het aantal mensen dat getroffen is door SFP is slechts een schatting vanwege verkeerde diagnoses en kleine uitbraken die niet worden gemeld. Ziekenhuisopname is zeldzaam, maar is waargenomen bij mensen die immuungecompromitteerd zijn, in het bijzonder ouderen en zeer jonge mensen (Scallan et al., 2011).

Staphylococcen zijn normaal aanwezig op menselijke huid en slijmvliezen met ongeveer 20-30% voor persistente en 60% voor intermitterende kolonisatie (Kluytmans et al., 2005). Voedselbehandelaars die gekoloniseerd zijn met enterotoxigene stafylokokken worden beschouwd als de belangrijkste bron van voedselbesmetting door direct contact met de producten of contactoppervlakken. Dieren zoals melkvee kunnen ook stafylokokken bij zich dragen en een bron van besmetting vormen voor melk en melkproducten. Ten slotte kunnen stafylokokken die in de omgeving aanwezig zijn, worden overgedragen op voedingsmiddelen en zo dienen als een potentiële bron van besmetting (Gutiérrez et al., 2012).

Voedingsmiddelen die vaak in verband worden gebracht met SFP zijn verwerkte voedingsmiddelen, vlees, gevogelte, zuivel en bakkerijproducten. Zodra het voedsel is besmet, kunnen stafylokokken groeien en enterotoxinen produceren, vooral als er geen goede productieomstandigheden worden gevolgd die groei voorkomen, zoals gekoelde opslagomstandigheden of hittedodende stappen zoals pasteurisatie (Gutiérrez et al., 2012). Staphylococcus-enterotoxinen zijn hittestabiel en worden niet gedenatureerd tenzij ze gedurende lange tijd aan hoge temperaturen worden blootgesteld, d.w.z, autoclaaf bij 121°C (250°F) bij 15 PSI gedurende 60 minuten (CDC, 2007).

Staphylococcus aureus wordt het meest in verband gebracht met uitbraken van stafylokokken-voedselvergiftiging, maar andere enterotoxigene coagulase positieve stafylokokken zoals S. hyicus en S. intermedius zijn ook betrokken bij uitbraken (Hennekinne et al., 2010). Staphylococcus enterotoxinen (SE’s) zijn pyrogene exotoxinen met superantigene activiteit. Enterotoxinen zijn bolvormige eiwitten die resistent zijn tegen hitte en proteasen met een moleculaire grootte van gemiddeld ongeveer 25 kDa. De schattingen voor de hoeveelheid toxine die nodig is om ziekte te veroorzaken zijn zeer laag. Bij een uitbraak in verband met chocolademelk werden SEA-niveaus van 0,5ng/ml gevonden (Evenson et al., 1988) en bij een uitbraak in verband met poedermelk werd 0,38ng/ml SEA gevonden (Asao, et al., 2003).

Klassieke SE’s (SEA-SEE) en niet-klassieke SE’s, SEG, SEH, SEI, SER en SET hebben bewezen emetische activiteit. Emetische activiteit voor SE-achtige enterotoxinen SElJ-SElQ, SElS, SElU, en SElV moet nog worden aangetoond. Alle se- en sel-genen zijn gelokaliseerd op mobiele genetische elementen, waaronder bacteriofagen, pathogeniciteitseilanden, plasmiden of transposons (Argudin et al., 2012).

Detectie van SE’s is van het grootste belang voor de voedselveiligheid en de bescherming van de voedselvoorziening. SE-detectiemethoden berusten op in de handel verkrijgbare polyvalente enzyme-linked immunoassays (ELISA) of enzyme-linked fluorescent immunoassay (EFLA) met antilichamen die SEA-SEE detecteren. Monovalente methoden zijn specifiek voor SEA-SEE en kunnen worden gebruikt om deze typen van elkaar te onderscheiden. De methoden vereisen extractie van enterotoxine uit verdachte levensmiddelen vóór de analyse. De gevoeligheid en selectiviteit van de methode worden verbeterd met dialyseconcentratie van het voedselextract, maar door tijdgebrek kan het nodig zijn eerst een test zonder concentratie uit te voeren. Toch moet dialyseconcentratie worden uitgevoerd op alle zuivelproducten voorafgaand aan de analyse (Hennekinne et al., 2012).

LET OP: Staphylococcus-enterotoxinen zijn zeer toxisch en procedures die aërosolen kunnen veroorzaken, moeten worden uitgevoerd in een goedgekeurde biologische veiligheidskast (BSC). Staphylococcus-enterotoxinen (SEA, SEB, SEC, SED, en SEE) zijn select agents. Wetenschappers moeten de door CDC opgestelde richtlijnen volgen: https://www.selectagents.gov/faq-general.html.

  1. Speciale apparatuur en materialen
    1. Temperatuurgeregelde kamer of koelkast 2-8°C.
    2. Blender of homogenisator.
    3. Incubator 35-37°C.
    4. Analytische balans en weegschalen.
    5. Tray voor dialyse.
    6. pH-meter. De pH tijdens de extractie en de pH van de bij de extractie gebruikte buffers zijn belangrijk. Maak aanpassingen binnen ± 0,1 pH-eenheid.
    7. Gekoelde centrifuge 2-8°C.
    8. Laboratoriumgerei van glas of polypropyleen om adsorptie van toxines te voorkomen.
    9. Filterdoek wordt gebruikt om debris na centrifugatie op te vangen. Vaak worden hiervoor verschillende lagen vooraf bevochtigde grove kaasdoek gebruikt.
    10. Filtertrechter.
    11. Dialysemembraan MWCO 6.000-8.000 Daltons (bv. Spectra/Por® met sluitingen) vlakke breedte 23 ± 2 mm.
    12. Vacuümconische buisfiltratieapparatuur (0,22 µm membraan) zoals Steriflip (EMD Millipore) aanbevolen voor het filtreren van vloeibare kweeksupernatanten als veiligheidsmaatregel om aërosolvorming van enterotoxinen te voorkomen.
    13. Biologische veiligheidskabinet.
  2. Reagentia

    Note: kitfabrikanten kunnen andere buffers of oplosmiddelen vereisen.

    1. Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS-oplossing) pH 7,3 + 0,2 (NaCl/Na2HPO4: 145 mM/10 mM) Om 1L PBS te bereiden, lost u 9 g NaCl en 3,58 g Na2HPO4 op in 1L gedestilleerd water. Pas de pH aan tot 7,2 ± 0,2 met behulp van HCl.
    2. Natriumchloride (NaCl).
    3. Natriumfosfaat (Na2HPO4).
    4. Polyethyleenglycol (PEG) (20.000 mol wt) Bereid 30% (w/v) PEG-oplossing door 30 g PEG toe te voegen voor elke 70 ml gedestilleerd water.
    5. 1 N (of 0,1 N) NaOH.
    6. 1 N (of 0,1 N) HCl.
  3. Voorbereiding van dialysemembraan
    Snijd het dialysemembraan lang genoeg om het te concentreren voedselextract te kunnen bevatten. Week de slang in twee keer gedestilleerd water om de glycerollaag te verwijderen. Gebruik een membraansluiting of bind een uiteinde van de slang met 2 knopen dicht bij elkaar. Vul de buis met gedestilleerd water en controleer op lekken door in de gevulde zak te knijpen terwijl het open uiteinde goed gesloten wordt gehouden.
  4. Extractie van enterotoxine uit voedselportie

    OPMERKING: deze procedure en andere procedures die aërosolen van pathogene micro-organismen of enterotoxinen kunnen genereren, moeten worden uitgevoerd in een goedgekeurde bioveiligheidskast.

    1. Maal indien mogelijk het hele voedselproduct of porties van representatieve selecties van het product in een blender om het monster te homogeniseren, zodat eventueel in het voedsel aanwezig SE gelijkmatig wordt verdeeld.
      1. Voor kazen met korst neemt u een kaasmonster met 10% korst en 90% kaas.
      2. Voor gedroogde producten gebruikt u gelijke hoeveelheden water bij het product om te mengen of volgt u de aanwijzingen van de fabrikant.
    2. Weeg 25 g monster af in een glazen bekerglas en breng de testportie over in een blender met 40 ml gedestilleerd water en meng op hoge snelheid gedurende 3 minuten, zodat een gehomogeniseerde slurry ontstaat. Voeg geen water toe aan vloeibare monsters, maar ga verder met stap 3.
    3. Laat het toxine diffunderen door het monster gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te schudden.
    4. Zuur het mengsel aan met 0,1N HCl tot een pH tussen 3,5 en 4,0. Opmerking: als de pH onder 3,0 daalt, moet nog een portie van 25 g worden bereid.
    5. Susporteer aangezuurde slurry over in conische propyleenbuizen van 50 ml. Centrifugeer bij 3.130 × g gedurende 20 min bij 5°C. Lagere snelheden met een langere centrifugetijd kunnen worden gebruikt, maar het klaren van sommige voedingsmiddelen is dan niet zo effectief. Scheiding van vette materialen is niet effectief tenzij het voedsel bij gekoelde temperatuur wordt gecentrifugeerd.
    6. Decanteer de bovenstaande vloeistof in een bekerglas van 800 ml door kaasdoek of ander geschikt filtermateriaal dat in een scheitrechter is geplaatst. Als het supernatans niet helder is, centrifugeer dan opnieuw en decanteer de vloeistof door het kaasdoek. Test de pH die tussen 3,5 en 4,5 moet liggen. Als de pH juist is, neutraliseert u het mengsel met 0,1N NaOH om een pH tussen 7,4 en 7,6 te verkrijgen.
    7. Als de pH >4,5 is, herhaalt u de aanzuring, maar als <3,0 of=””>9,0 herhaalt u het proces met nog een portie van 25 g voedsel.
    8. Als er voldoende monster voorhanden is om de test te herhalen, kan een aliquot worden genomen voor screening met een gevalideerde assay (zie punt H). Als de screeningresultaten negatief zijn, moet het resterende extract met dialyse worden geconcentreerd en opnieuw worden getest.
  5. Dialyseconcentratie van het extract
    1. Doe het extract in een voorbereide dialysezak. Leg de gesloten zak neer in een schaal en dompel de zak onder in 30% (w/v) PEG. Houd bij 5°C tot het volume is gereduceerd tot 15-20 ml of minder. Dit proces kan 24-72 uur duren, maar als het volume niet verminderd is na een nacht, voeg dan PEG in poedervorm toe aan de bak. Haal de zak uit de PEG en was de buitenkant grondig met water om eventueel aan de zak klevende PEG te verwijderen. Laat 1-2 min. weken in gedestilleerd water. Giet de inhoud in een klein bekerglas.
    2. Spoel de binnenkant van de zak met 2-3 ml gedestilleerd water (PBS wordt gebruikt voor melk en zuivelproducten) door met de vingers langs de buitenkant van de zak op en neer te gaan om materiaal te verwijderen dat aan de zijkanten van de buis vastzit. Herhaal het spoelen totdat het spoelwater helder is. Houd het volume zo klein mogelijk.
    3. Verstel de pH van het extract op 7,4-7,6.
    4. Geconcentreerde extracten moeten binnen 48 uur worden geanalyseerd en bij 3-5°C worden bewaard; anders de extracten bij 18-20°C invriezen en vóór de tests bij 3-5°C volledig ontdooien. Sommige bepalingen, zoals de Vidas SET2, vereisen onmiddellijke analyse.
  6. SE-tests van bacteriële culturen

    Staphylokokkenstammen die ervan verdacht worden enterotoxinen te produceren, kunnen vooraf worden verrijkt in een voedingsbodem zoals TSB of BHI.

    1. Schenk twee of drie morfologisch vergelijkbare kolonies over op 10 ml voedingsbodem.
    2. Incubeer bij 35-37°C ’s nachts op een rondschudapparaat.
    3. Centrifugeer de culturen 5 minuten 3500 × g bij 10°C
    4. Filter het supernatans met een Steri-Flip vacuümfilterapparaat met een 0,22 µm filter of een ander gesloten systeem om aerosolisatie van enterotoxinen te voorkomen. Deze procedure moet worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskabinet om de veiligheid van de wetenschapper te waarborgen.
    5. Cultuursupernatanten kunnen hoge SE-gehalten bevatten die buiten het lineaire bereik van de kit liggen, zodat verdunning met PBS nodig kan zijn.
  7. Rapportering van resultaten

    De aanwezigheid van stafylokokken-enterotoxine die in levensmiddelen is gedetecteerd, moet worden gerapporteerd aan het Federal Select Agent Program dat wordt beheerd door het Center for Disease Control and Protection (CDC): https://www.selectagents.gov/form4.html door invulling van APHIS/CDC-formulier 4.

    Positieve resultaten worden gerapporteerd als Staphylococcus-enterotoxine gedetecteerd in × g (ml) product. Negatieve resultaten worden gerapporteerd als Staphylococcus-enterotoxine niet gedetecteerd in × g (ml) product.

  8. Notes

    De kit moet enterotoxine kunnen detecteren op het minimumniveau van 0,05ng/g met hoge niveaus van relatieve gevoeligheid (>90%) en relatieve specificiteit (>90%).

    De vermelding van handelsnamen of commerciële producten in de methode is uitsluitend bedoeld ter wetenschappelijke informatie en impliceert geen aanbeveling of goedkeuring door de U. S. Food and Drug Administration. Twee methoden die vaak worden gebruikt voor SE-detectie zijn de door de AOAC goedgekeurde Vidas SET2 (bioMerieux, Inc), een geautomatiseerde polyvalente enzyme linked fluorescent assay (EFLA) die SEA-SEE detecteert (AOAC Official Method 2007.06 VIDAS SET2 for Detection of Staphylococcal Enterotoxin in Select Foods, Final Action, 2010). Het huidige catalogusnummer voor Vidas Set2 is Ref. 30705. De Ridascreen SET Total (R-Biopharm AG) is een manuele enzymgekoppelde immunoassay die wordt uitgevoerd in putjes gecoat met polyvalente antilichamen. De polyvalente Ridascreen-kit detecteert stafylokokken-enterotoxinen SEA-SEE en is gevalideerd en geverifieerd aan de hand van grondige ringtests en validatiestudies door derden onder leiding van het referentielaboratorium van de Europese Unie voor coagulasepositieve stafylokokken voor het mandaat van de Europese Commissie voor Normalisatie (CEN) voorgestelde ISO-norm 19020. Er is een monovalente kit Ridascreen Set A,B,C,D,E (R-Biopharm AG) beschikbaar, maar deze kit is niet door een derde partij gevalideerd. Het catalogusnummer voor de polyvalente Set Total kit is R4105 (96 tests) of R4106 (48 tests) . Het catalogusnummer voor de SET A,B,C,D,E monovalente kit is R4101.

Interferenties

Niet-specifieke reacties kunnen optreden in voedingsmiddelen die endogene enzymen bevatten zoals lactoperoxidase of alkalische fosfatase en interfereren met kits zoals Vidas SET2 dat alkalische fosfatase gebruikt als detectie-enzym (Vernozy-Rozand, et al., 2005). Aanbevolen wordt om alle positieve resultaten te bevestigen met een alternatieve methode die gebruik maakt van een ander detectie-enzym. In het geval van de Vidas SET2 is een alternatieve methode de Ridascreen SET Total die gebruik maakt van lactoperoxidase.

Een warmtebehandeling kan worden toegepast om endogeen alkalische fosfatase uit het monster te verwijderen, en wel als volgt:

  • Schenk 600 μL geconcentreerd extract in een buisje
  • Verhit 80°C gedurende 2 minuten
  • Herhaal de Vidas SET2-assay met het afgekoelde concentraat. Er kan enig verlies van enterotoxine optreden.

Als een onnauwkeurig resultaat wordt vermoed met de Ridascreen of een andere kit die lactoperoxidase gebruikt, breng dan 100 μL geconcentreerd extract over in een buisje. Voeg 50 ul substraat en chromagene oplossingen toe. Meng en observeer voor een blauw-groene kleur. Als een blauwgroene kleur verschijnt, is dat een aanwijzing dat intrinsiek lactoperoxidase aanwezig is in het monster en interfereert met de assay. Daarom moet een andere detectiemethode worden gebruikt.

  1. Argudin, MA, Mendoza, MC, and Rodicio MR. Voedselvergiftiging en Staphylococcus aureus enterotoxinen. Toxins 2010, 2, 1751-1773.
  2. Argudin, MA, Mendoza, MC, Gonzáalez-Hevia, MA, Bances, M, Guerra, B, and Rodicio MR. Genotypen, exotoxinegengehalte en antimicrobiële resistentie van Staphylococcus aureus-stammen die zijn teruggevonden uit levensmiddelen en van personen die met levensmiddelen omgaan. AEM 2012 78 2930-2935.
  3. Asao, T, Kumeda, Y, Kawai, T, Shibata, T, Oda, H, Nakazawa, H, and Lozaki, S. An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low-fat milk in Japan: estimation of entertoxin A in the incriminated milk and powdered skim milk. Epidemiol. Infect., 2003, 130, 33-40.
  4. Centers for Disease Control/National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Vijfde editie, 2007, Evenson, ML, Hinds, MW, Bernstein, RS, Befgdoll, MS. Schatting van de menselijke dosis stafylokokken-enterotoxine A bij een grote uitbraak van stafylokokken-voedselvergiftiging met chocolademelk. Int J Food Microbiol 1988, 31, 311-316.
  5. Gutiérrez, D, Delgado, S, Vázquez-Sánchez, D, Martinez, B, Caba, ML, Rodriguez, A, Herrera, JJ, and Garcia, P. Incidence of Staphylococcus aureus and Analysis of Associated Bacterial Communities on Food Industry Surfaces. AEM 2012, 78, 8547-8554.
  6. Hennekinne, JA, Ostyn, A, Fuillier, F, Hervin, S, Prufer, AL, and Dragacci, S. How Should Staphylococcal Food Poisoning Outbreaks be Characterized? Toxins, 2010, 2, 2106-2116.
  7. Hennekinne, JA, De Buyser, MA, and Dragacci, S. Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation. FEMS Microbiol Rev, 2012, 36, 815-836.
  8. Kluytmans, JAJW, and Wertheim, HFL. Nasal carriage of Staphylococcus aureus and prevention of nosocomial infections. Infection 2005, 33, 3-8.
  9. Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson M-A, Roy SL, et al. Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 2011 Jan. http://www.cdc.gov/EID/content/17/1/7.htm
  10. Vernozy-Rozand, C., Mazuy-Cruchaudet, C., Bavai, C. and Richard, Y. (2004), Comparison of three immunological methods for detecting staphylococcal enterotoxins from food. Lett App Microbiol, 2004, 39, 490-494 . doi:10.1111/j.1472-765X.2004.01602.x

Leave a Reply