Origin of the electrophoretic force on DNA in solid-state nanopores

Voltage-gedreven transport van macromoleculen door biologische6,7 en kunstmatige8,9,10,11,12 nanoporiën biedt een ideaal systeem voor het bestuderen van de fysica van het translocatieproces13. Elektroforetische migratie is de belangrijkste drijvende kracht voor DNA translocatie door nanoporiën en is een gevolg van de kracht uitgeoefend door een extern toegepast elektrisch veld op de ladingen op de polyelektrolyt keten. Aangezien DNA in oplossing negatief geladen is, wordt het afgeschermd door een laag van min of meer mobiele, positief geladen tegenionen die ook het elektrisch veld ondervinden. Het is al lang bekend dat de kracht die wordt uitgeoefend op de tegenionen een hydrodynamische trekkracht op het DNA induceert die lokaal de elektrische kracht compenseert, wat leidt tot een veel tragere migratie dan zou worden verwacht op basis van Stokes trekkracht alleen (zie bijvoorbeeld ref. 1). De elektroforetische translocatie van een polymeer door een kleine porie gehoorzaamt aan soortgelijke principes, maar hier wordt verwacht dat de geometrie van de porie (of de plaatselijke structuur van de gel) het hydrodynamische stromingsprofiel rond het DNA en daardoor de weerstand tegen de beweging sterk zal beïnvloeden1,5,14. Ondanks steeds meer geavanceerde experimenten 3,12,15,16, een ondubbelzinnige manifestatie van hydrodynamische interacties in DNA translocatie is nog niet gemeld. Hier pakken we dit probleem met behulp van onze recent ontwikkelde apparatuur een combinatie van solid-state nanoporiën met optische pincet 3 tot DNA translocatie arresteren, en vervolgens meten van de blokkade kracht op een enkele DNA-streng (zie de sectie Methoden). Een schematisch diagram van de meetapparatuur wordt getoond in Fig. 1a.

a, Schematisch diagram van de meetapparatuur. Met behulp van een optisch pincet wordt de DNA translocatie tot stilstand gebracht en wordt de kracht op het DNA gemeten. Tegelijkertijd wordt de ionengeleiding van de nanoporie gemeten. b) Cilindrisch model van DNA in een nanoporie. De blauwe pijlen aan weerszijden van het DNA geven schematisch de snelheid van de bewegende vloeistof als gevolg van elektro-osmose weer.

In tegenstelling tot een gelelektroforese-experiment blijft het elektrische veld in een nanopore-experiment beperkt tot de onmiddellijke omgeving van de porie en werken de elektrische krachten lokaal in op een kort segment van het DNA. De elektrische veldsterkte in de porie bereikt typisch ∼106 V m-1 ten gevolge van de zeer dunne (∼60 nm) vrijstaande membranen. De grote persistentie-lengte van λ-DNA, ongeveer 50 nm, zorgt ervoor dat het DNA-segment binnen de porie praktisch volledig is uitgestrekt. De situatie wordt schematisch weergegeven in fig. 1b, waarbij L en R de lengte en de straal van de porie voorstellen en ΔV de toegepaste potentiaal is. DNA heeft een kale lijn ladingsdichtheid λbare=-0.96 nC m-1 (2 elektronen per basenpaar) en wordt hier gemodelleerd als een uniform geladen cilinder met straal a=1.1 nm. De blote elektrostatische kracht op de DNA-backbone wordt voorgesteld door Fbare=λbareΔV (ref. 3). Deze wordt tegengewerkt door een weerstandskracht Fdrag veroorzaakt door de elektroforetische beweging van de tegenionen in de tegenovergestelde richting: Fdrag is dus een intrinsieke component van het translocatieproces die uiteindelijk ook terug te voeren is op elektrische krachten5. De resulterende nettokracht is de elektroforetische kracht die de translocatie aandrijft, gegeven door Felec=Fbare-Fdrag. In ons geval, Felec wordt gecompenseerd door een tegengestelde mechanische kracht Fmech = Felec van de optische pincet dat het DNA arresteert in de porie

De oorsprong van Fdrag ligt in de ruimtelijke verdeling van de ionen en de bijbehorende vloeistof stroom profiel. Een gemiddelde-veld beschrijving van de ionenverdelingen wordt gegeven door het Poisson-Boltzmann formalisme, waarin de elektrostatische potentiaal wordt gegeven door en de bijbehorende ionenverdelingen als . Hier λD de Debye-lengte, de gereduceerde elektrostatische potentiaal, e de elementaire lading, Φ de potentiaal, kB de Boltzmann-constante, T de temperatuur, n de getalsdichtheid van ionen en z de valentie van de ionische soorten. Figuur 2a toont berekende potentialen voor twee poriegrootten verkregen door numerieke evaluatie van de Poisson-Boltzmann-vergelijking in een cilindrische geometrie (zie het gedeelte Methoden). De overeenkomstige ionendistributies worden getoond in Fig. 2b. De Debye-laag van het DNA wordt gekenmerkt door een depletie van coionen, terwijl tegenionen zich ophopen tot zeer hoge dichtheden ten gevolge van de hoge DNA-lading. Aangezien deze verdelingen oplossingen zijn van de volledige (niet-gelineariseerde) Poisson-Boltzmann-vergelijking, is het effect van Manning-condensatie17 inbegrepen.

a, Gereduceerde elektrostatische potentiaal voor een ‘grote’ porie (groen, R=10 nm) en een ‘kleine’ porie (blauw, R=3 nm). De grijze lijn geeft de plaats van de poriewand aan voor de kleine porie. De zoutconcentratie is cbulk=20 mM (λD=2.2 nm) en de poriewanden zijn in deze berekening voor het gemak als ongeladen genomen. b, Overeenkomstige ionendistributies. In “grote” poriën (R≫λD) wordt de ionenverdeling rond het DNA niet significant beïnvloed door de poriewand, zoals blijkt uit de waarneming dat de groene curven de bulkwaarde bereiken. In “kleine” poriën (R≲λD) wordt de tegenionenwolk (vaste curven) echter samengedrukt door de poriewand en kan de porie uitgeput raken van ionen (gestippelde curven), waardoor voornamelijk positieve tegenionen overblijven om de negatieve ladingen op het DNA in evenwicht te houden. Deze situatie wordt geïllustreerd door de blauwe curven. c, Snelheidsprofielen van de vloeistof berekend door de resultaten van a en b te combineren met de vergelijking van Stokes. d, Genormaliseerde oppervlakte-integraal van de afschuifspanning op elke positie r, berekend als , waarbij τ de afschuifspanning in de vloeistof is. Op het DNA-oppervlak, . e, Berekende gereduceerde oppervlakte potentialen voor DNA (rood) en nanopore wand (grijs) als functie van de porie straal. Het grijze gebied geeft kwalitatief het ‘kleine porie’ gebied, waarin de ionenverdelingen worden beïnvloed door de opsluiting van de nanopore.

In onze DNA stalken experiment, de verdeling van de tegenionen grotendeels bepaalt het snelheidsprofiel van de geïnduceerde elektro-osmotische stroom. Het stromingssnelheidsprofiel kan worden berekend door de Stokes-vergelijking op te lossen , waarbij η de dynamische viscositeit van de vloeistof is, vz de vloeistofsnelheid, Ez het toegepaste elektrische veld en ρ(r) de ionische ladingsverdeling. De berekende vloeistofstromingsprofielen worden getoond in Fig. 2c. Vervolgens, om het stromingsprofiel met viskeuze weerstand in verband te brengen, wordt de afschuifspanning in de vloeistof berekend als τ(r)=-η(dvz/dr). Figuur 2d toont , die gelijk is aan de verhouding Fdrag/Fbare wanneer deze wordt geëvalueerd aan het DNA-oppervlak (r=a). Hieruit blijkt dat Fdrag van dezelfde orde van grootte is als de kale elektrostatische kracht die op het DNA werkt en waartegen hij gericht is. Fdrag is groter voor de grotere porie, wat overeenkomt met een kleinere blokkade kracht.

Voor vergelijking met onze experimenten, is het handig om het bovenstaande model uit te drukken in een vorm die direct betrekking heeft de elektroforetische kracht aan de eigenschappen van de nanoporie. Zoals eerder is aangetoond 5, kan de Poisson-Boltzmann en Stokes vergelijkingen worden gecombineerd tot een uitdrukking voor de elektroforetische kracht op een stationaire molecuul opleveren,

Φ (a) en Φ (R) zijn de oppervlakte potentialen van het DNA en de nanoporie, respectievelijk, en ε is de diëlektrische constante van water. en afgeleid van de Poisson-Boltzmann vergelijking zijn uitgezet in Fig. 2e als functie van R. In grote poriën, de oppervlakte potentialen zijn onafhankelijk van R. Vergelijking (1) voorspelt dan dat de gemeten kracht Fmech een eenvoudige ln-1 (R / A) afhankelijkheid van de grootte van de porie heeft. In kleinere poriën daarentegen wordt de Debye-laag samengedrukt door de poriewand (Fig. 2). Dit resulteert in een afhankelijkheid van de oppervlaktepotentialen van de poriegrootte en een dienovereenkomstig gecompliceerdere afhankelijkheid van Fmech van R.

Een manier om het bovenstaande model direct te testen is het meten van de DNA-vasthoudkracht Fmech als functie van de poriestraal R. Aangezien eerder werk zich heeft gericht op kleinere poriën, tonen we echter eerst aan dat het mogelijk is om de aanwezigheid van een enkel DNA-molecuul te detecteren in zeer grote (R≫a) nanoporiën. De detectie van DNA in de porie is gebaseerd op het meten van de stap in ionische geleiding ΔG wanneer DNA de porie binnenkomt. Eerder is aangetoond dat ΔG wordt veroorzaakt door concurrentie tussen twee bijdragen: volume-exclusie, waardoor het aantal ionen dat beschikbaar is voor geleiding daalt, en een overmaat aan DNA-tegenionen, waardoor het aantal ionen dat beschikbaar is voor geleiding effectief toeneemt12. Welke van deze twee effecten domineert hangt af van de bulkconcentratie van de elektrolyt, waardoor ΔG positief is (toename van de geleiding) in de huidige experimenten met 20-50 mM zout. Onder deze geoptimaliseerde zoutcondities wordt voorspeld dat de signaal-ruisverhouding van de DNA-vangst hoog zal zijn, zelfs in zeer grote poriën18. Een typische stap in de stroom samen met de overeenkomstige verandering in positie Z van de kraal wordt getoond in Fig. 3a. We zien een duidelijke stap in de stroom, ook al verandert het DNA de geleiding van de nanoporie met minder dan 1%. Een typisch histogram van de vangstgebeurtenissen is te zien in Fig. 3b. Deze gegevens tonen aan dat we in staat zijn om gecontroleerd enkele moleculen in te brengen en te detecteren, zelfs in nanoporiën met R=45 nm, waar het DNA slechts 1/2000ste van de nanoporiedwarsdoorsnede bedekt.

a, Typisch voorbeeld van de porie stroom I (bovenste paneel, rood gemiddeld) en kraal positie Z (onderste paneel) tijdens de DNA-opname in een R = 39 nm porie in 33 mM KCl bij 80 mV. Huidige metingen werden laagdoorlaatfilter bij 1 kHz. b, Histogram van ΔG van 88 DNA vangt in de nanopore onder dezelfde omstandigheden als in a. c, ΔG in poriën van verschillende radii. Capture gebeurtenissen typisch voorgedaan bij spanningen van 60-100 mV. De horizontale stippellijn is een richtlijn voor het oog. Driehoeken: 20 mM KCl, sterren: 33 mM KCl, ruiten: 50 mM KCl, groene ster: gegevens uit b, foutbalkjes: standaardafwijking geëvalueerd uit ΔG histogrammen. De open symbolen vertegenwoordigen gegevens van vrije translocatie-experimenten zonder optische pincetten.

Experimenteel bepaalde ΔG-waarden als functie van de nanoporestraal worden getoond in Fig. 3c voor 10 nanoporiën met stralen variërend van R=3 tot 45 nm. Het grijze gebied geeft het ‘kleine porie’ gebied aan waarin, volgens de berekeningen in Fig. 2b, de ionendistributies nabij het DNA beïnvloed worden door de aanwezigheid van de nanoporiewand. In schijnbare overeenstemming met de simulaties is ΔG ongeveer constant in grote nanoporiën. De grotere ΔG in kleine nanoporiën is consistent met de compressie van de diffuse screening laag, waardoor lading neutraliteit in de porie. Een meer kwantitatieve vergelijking van de gemeten ΔG met de theorie is echter moeilijk: de toegangsweerstand Racc wordt een steeds belangrijkere bijdrage tot de totale weerstand van het systeem in grote poriën19, en het is momenteel onbekend hoe de aanwezigheid van DNA draden door de porie Racc beïnvloedt.

Hebben vastgesteld dat het mogelijk is DNA-moleculen in zowel grote als kleine poriën vast te houden en te detecteren, wenden we ons nu tot het belangrijkste resultaat van deze brief, namelijk de experimenteel bepaalde grootte van de blokkadekracht Fmech als functie van de nanoporie-radius R. Figuur 4a toont Fmech als functie van de aangelegde spanning ΔV in nanoporiën met R=4 nm (linker paneel) en R=39 nm (rechter paneel). Deze relatie is ongeveer lineair in beide gevallen. Echter, Fmech / ΔV in de kleine porie is een factor twee groter dan in de grote porie. Figuur 4b toont de verhouding Fmech/ΔV als functie van de poriegrootte: Fmech/ΔV neemt geleidelijk af met toenemende grootte, zoals verwacht op basis van vergelijking (1). De gestippelde curve is het resultaat van de combinatie van de oppervlaktepotentialen voor de volledige DNA-lading (fig. 2e) met vergelijking (1), zonder enige extra aanpassingen. Ondanks de inherente vereenvoudigingen van een eendimensionaal model, geeft het theoretische resultaat de trend in de gegevens vrij goed weer, hoewel het de blokkadekracht kwantitatief overschat met ∼50%. Dit verschil kan worden toegeschreven aan (een combinatie van) verschillende factoren, waaronder een vermindering van de tegenionen mobiliteit aan het DNA-oppervlak 12,20, of een extra tegengestelde electro-osmotische vloeistofstroom als gevolg van vaste ladingen op het nanopore oppervlak 5. In termen van vergelijking (1), kunnen beide effecten worden vertegenwoordigd door het verlagen van de grootte van het oppervlak potentiaalverschil ΔΦ =Φ (a) -Φ (R), waardoor de grootte van Fmech. Empirisch verminderen Δ Φ met 33% resulteert in de solide curve in Fig. 4b, een uitstekende pasvorm voor de experimentele gegevens. Deze vermindering van Δ Φ is gelijk aan ongeveer 50% van de blote lading van het DNA wordt afgeschermd door ionen die effectief zijn geïmmobiliseerd op het oppervlak (zoals weergegeven in aanvullende Fig. S1) of de aanwezigheid van een 15 mC m-2 oppervlaktelading op de porie wand (aanvullende Fig. S2). Hoewel ons experiment niet direct onderscheid kan maken tussen deze twee mechanismen, is de afgeleide oppervlakteladingsdichtheid typerend voor SiO2-oppervlakken21. Dit suggereert dat de oppervlakteladingsdichtheid in onze nanoporiën niet sterk wordt beïnvloed door het fabricageproces en dat de poriënlading verantwoordelijk is voor een aanzienlijk deel van de waargenomen correctie.

a, Metingen van de vasthoudkracht als functie van het toegepaste potentieel in een kleine (linkerpaneel) en een grote nanoporie (rechterpaneel). In elk geval worden twee metingen op verschillende afstanden tussen de kraal en de nanoporie getoond. b) Gemeten kracht versus poriënradius. De blauwe en groene symbolen komen overeen met de gegevens in a. De gegevens in het gebied met kleine poriën zijn afkomstig uit ref. 3. De curven vertegenwoordigen het theoretische resultaat voor de kale DNA lading (stippellijn curve) en voor een verminderde Δ Φ (ononderbroken lijn, zie tekst). De inzet toont schematisch hoe de kracht op het DNA tegenionen is verdeeld tussen het DNA en de poriewanden door viskeuze weerstand in een kleine en een grote porie, de gele pijl vertegenwoordigt de kale elektrostatische kracht die op het DNA. Driehoeken: 20 mM KCl, sterren: 33 mM KCl, ruiten: 50 mM KCl. De foutbalkjes zijn het gevolg van de onzekerheden in de kalibratie van de optische val, die worden geschat op 10-30% van de gekalibreerde valstijfheid.

Externe factoren waarmee in ons eenvoudige model geen rekening is gehouden, kunnen ook van invloed zijn op de absolute waarde van de blokkadekracht. Bijvoorbeeld, kan het worden beïnvloed door elektrostatische en / of hydrodynamische krachten op de kraal of op het deel van het DNA die in het elektrische veld net buiten de nanopore. Echter, onze experimenten tonen geen bewijs voor dergelijke effecten, zoals we geen verandering in de blokkade kracht gedetecteerd wanneer de kraal werd gepositioneerd op toenemende afstanden van de nanopore 3. Bovendien zijn de experimentele kracht-spanningscurven lineair in ons spanningsbereik (Fig. 4a), wat aangeeft dat de entropische krachten klein zijn in vergelijking met de elektrostatische krachten, consistent met onafhankelijke metingen van de entropische krachten in DNA-uitrekking22.

De afhankelijkheid van de gemeten kracht van de poriestraal in Fig. 4b toont direct aan dat de elektroforetische kracht in DNA translocatie gedeeltelijk wordt bepaald door hydrodynamische koppeling tussen de tegenionen van het DNA en de nanoporiewand. De geometrie van de nanoporie bepaalt de grootte van de trekkracht die door deze tegenionen op het DNA wordt uitgeoefend. Deze koppeling heeft belangrijke gevolgen voor de interpretatie van experimenteel bepaalde krachten omdat deze krachten duidelijk niet worden bepaald door de intrinsieke eigenschappen van het DNA alleen1,23.

Variaties van de kracht kunnen ook worden verwacht met toenemende zoutconcentratie omdat dit de Debye-lengte verandert en daarmee zowel de DNA-oppervlakpotentiaal als vermoedelijk de blokkeerkracht Fmech. Deze verwachting wordt echter gecompliceerd door het feit dat de ladingsdichtheid van het porieoppervlak ook aanzienlijk verandert met de zoutconcentratie12 en dat de gemiddelde-veldtheorie die hier wordt gebruikt onbetrouwbaar wordt bij hoge ionensterkte. In eerdere experimenten werd Fmech in feite gevonden onafhankelijk te zijn van de zoutconcentratie tot 1 M (ref. 3), en een interpretatie van die gegevens op basis van een model waarin Φ (R) afhankelijk van de zoutconcentratie werd voorgesteld door Ghosal 5.

In vrije DNA translocatie, de rustende kracht Fmech afwezig is en effectief vervangen door een extra Stokes weerstand FStokes evenredig met de snelheid van het molecuul. Het molecuul verplaatst zich met constante snelheid, waarbij de elektroforetische kracht wordt gecompenseerd door FStokes. Het verband tussen de blokkadekracht Fmech, zoals gemeten met het optisch pincet, en de translocatiesnelheid vtrans, zoals bepaald uit vrije DNA translocatie-experimenten, wordt gegeven door4,5,14

Dit resultaat is equivalent aan de Stokesweerstand die zou worden ondervonden door een ongeladen cilinder translocerend door een cilindrische porie met constante snelheid vtrans. Fmech en vtrans zijn dus evenredige grootheden, gerelateerd door een geometrie-afhankelijke factor. Deze verwachting wordt kwalitatief bevestigd door experimentele gegevens3,12, waaruit blijkt dat Fmech en vtrans inderdaad ongeveer evenredig zijn. Berekening van vtrans als de λ-DNA-contourlengte gedeeld door de experimenteel bepaalde translocatietijd geeft vtrans=(16 μm/1,1 ms)≈15 mm s-1, resulterend in Fmech/vtrans=1,750 pN s m-1 (gegevens voor 5-nm-radius poriën). Vergelijking (2) geeft echter een waarde van 249 pN s m-1 voor deze factor, met η=1×10-3 N s m-2, L=60 nm, R=5 nm en a=1,1 nm. Dit is zeven maal lager dan de experimenteel verkregen waarde. Translocatie van DNA door deze poriën gebeurt dus met een veel lagere snelheid dan verwacht op grond van de elektroforetische krachten gemeten met het optisch pincet en de gemiddelde-veld beschrijving. Aangezien in al deze experimenten vergelijkbare nanoporiën zijn gebruikt, wijst deze conclusie op een fundamenteler verschil tussen de statische situatie van een stilstaand molecuul en de dynamische situatie van een translocerend molecuul. Bij vrije DNA translocatie resulteert de conformatie van het DNA buiten de porie in extra weerstand op het bewegende molecuul24, wat de discrepantie kan verklaren.

Concluderend hebben we aangetoond dat de elektroforetische kracht op een DNA-molecuul in een nanoporie afhangt van de geometrie van de porie. Dit wordt niet verwacht op basis van eenvoudige elektrostatica, maar kan eenvoudig worden begrepen door rekening te houden met de hydrodynamische weerstand die wordt geïnduceerd door de tegenionen die het DNA in oplossing afschermen. Numerieke berekeningen op basis van gemiddelde-veld vergelijkingen geven een goede beschrijving van de poriëngrootte afhankelijkheid van de gemeten krachten.