Neutrophil Diapedesis: Paracellular or Transcellular?

Eén van de klassieke kenmerken van ontsteking is infiltratie van het aangetaste weefsel door polymorfonucleaire leukocyten (PMN). Om dit te bewerkstelligen moeten circulerende PMN adhesieve interacties met het endotheel ondergaan, waardoor zij geactiveerd kunnen worden, afplatten en over de endotheliale bekleding van microvaten emigreren. De moleculaire determinanten van deze adhesieve interacties zijn uitgebreid bestudeerd, en er is een algemene consensus over de opeenvolging van gebeurtenissen die ertoe leiden dat PMN in een positie worden gebracht om in weefsel te emigreren (3, 12). In eerste instantie treedt er een zwakke kleefinteractie op tussen circulerend PMN en het endotheel die resulteert in een saltatoire beweging van PMN langs het endotheel, een fenomeen dat ‘rollen’ wordt genoemd. Door het rollen blijven de PMN dicht tegen het endotheel aanliggen, en als er plaatselijk ontstekings mediatoren aanwezig zijn, worden de PMN geactiveerd. Eenmaal geactiveerd, vormen de PMN sterkere adhesieve interacties met het endotheel die leiden tot hun arrestatie. Vervolgens emigreren de PMN over het endotheel. In tegenstelling tot de initiële adhesieve interacties (rollen en adhesie), waarover een algemene consensus bestaat over de betrokken mechanismen, is er weinig geweten over de mechanismen die betrokken zijn bij de transendotheliale migratie van PMN. Zelfs het uitgangspunt of PMN emigreren tussen endotheelcellen (paracellulaire route) of door de endotheelcellen zelf (transcellulaire route) is controversieel.

De heersende consensus is dat circulerende PMN emigreren van het intravasculaire compartiment naar het interstitium door tussen aangrenzende endotheelcellen te passeren, d.w.z. een paracellulaire route te gebruiken (11). Zowel in vivo als in vitro studies met behulp van elektronen- en lichtmicroscopie hebben migrerende PMN vastgelegd die pseudopodia tussen endotheelcellen uitsteken om de endotheelbarrière te passeren als reactie op een chemotactische gradiënt. Opdat PMN de paracellulaire weg voor transendotheliale migratie zouden kunnen gebruiken, moet de adhesieve koppeling tussen aangrenzende endotheelcellen verstoord worden en moeten endotheelcellen zich voldoende van elkaar scheiden om de passage van PMN mogelijk te maken. Veel ontstekingsmediatoren die worden gebruikt om ontsteking in vitro te simuleren, kunnen op zichzelf de vorming van spleten in gekweekte endotheelcelmonolagen induceren, d.w.z. endotheelcelretractie. Aangezien grote kloven tussen endotheelcellen echter zelden worden waargenomen in in vivo modellen van ontsteking, kan dit fenomeen een overdreven effect zijn van ontstekingsmediatoren in in vitro systemen. Gekweekte endotheliale monolagen hebben onderontwikkelde interendotheliale adhesieverbindingen in vergelijking met hun tegenhangers in vivo, en dus kunnen ontstekingsmediatoren in vitro gemakkelijker endotheliale celretractie veroorzaken dan in vivo (12). De in vivo correlaat van dit fenomeen is verhoogde macromoleculaire lekkage over interendotheliale knooppunten waargenomen in reactie op inflammatoire mediatoren. Tezamen bevestigen de in vitro studies het idee dat endotheelcellen zich van elkaar kunnen scheiden in reactie op ontstekingsmediatoren, zij het dat de mate van scheiding overdreven kan zijn.

Aanwijzingen dat PMN endotheelcelretractie kunnen induceren zijn voornamelijk afkomstig van in vitro studies die de mechanismen hebben onderzocht die betrokken zijn bij PMN-gemedieerde endotheelcelbeschadiging (12). Dit letsel was niet-lytisch van aard en manifesteerde zich als loslating van endotheelcellen van monolagen gekweekt op niet-poreuze oppervlakken. Deze loslating van endotheelcellen trad op 3-6 uur na het aanbrengen van geactiveerde PMN op het oppervlak van endotheelcelmonolagen en werd toegeschreven aan PMN-afgeleide elastase. Aangezien losgemaakte endotheelcellen zelden worden waargenomen in in vivo modellen van ontsteking, lijkt PMN-gemedieerde endotheelcelloslating ook een overdrijving te zijn van een in vivo gebeurtenis te wijten aan de experimentele omstandigheden opgelegd in vitro. In deze systemen (endotheliale monolagen gekweekt op niet-poreuze oppervlakken) is het de PMN niet toegestaan te transmigreren en zich van de endotheliale celmonolaag te verwijderen. Aldus blijven zij in de nabijheid van de endotheelcellen en volharden in proteolytische verergering van de monolayer, uiteindelijk leidend tot retractie van de endotheelcellen en daaropvolgende onthechting. Als de geactiveerde PMN over endotheelcelmonolagen mogen migreren, wordt zelden een grove retractie en onthechting van endotheelcellen waargenomen.

Elastase afkomstig van PMN kan retractie en onthechting van endotheelcellen binnen monolagen induceren. Dit is analoog aan het gebruik van proteasen om endotheelcellen uit te breiden, d.w.z. de met proteasen behandelde cellen trekken zich terug en maken zich los van het substraat, maar na behandeling met proteaseremmers kunnen ze opnieuw worden uitgezaaid en blijven ze normaal groeien. Interessant is dat zowel het terugtrekken van endotheelcellen als de transendotheliale migratie van PMN kan worden verhinderd door remmers van proteasen (bv. elastase). Deze laatste waarnemingen wijzen erop dat PMN endogeen elastase gebruiken om endotheelcelretractie te induceren van voldoende omvang om hen toe te laten tussen aangrenzende endotheelcellen te passeren zonder deze te beschadigen. Recente studies suggereren dat elastase-gemedieerde PMN transendotheliale migratie een sterk gereguleerd proces is dat geen PMN degranulatie vereist (3). De geactiveerde PMN scheiden geen elastase af in het extracellulaire milieu; in plaats daarvan mobiliseren ze elastase naar het membraan en lokaliseren het naar het migrerende front, b.v. de pseudopodia die tussen aangrenzende endotheelcellen binnendringen. Dat PMN degranulatie niet noodzakelijk is voor hun transendotheliale migratie wordt verder ondersteund door de observatie dat PMN cytoplasten (anucleaire PMN verstoken van granules) over endotheliale monolagen migreren in antwoord op een chemotactische gradiënt net zo efficiënt als normale PMN. Ook hier kan de transendotheliale migratie van cytoplasten worden verhinderd door elastaseremmers.

Endotheliale cellen worden bijeengehouden door adhesieverbindingen die bestaan uit transmembraanproteïnen (11). Om neutrofielen tussen endotheelcellen te laten passeren, moeten de adhesieve interacties van deze verbindingen worden verstoord. Er zijn twee adhesieverbindingen die relevant zijn voor PMN transendotheliale migratie: adherens verbindingen en tight junctions. Adherens juncties bestaan uit vasculaire-endotheliale (VE)-cadherine/catenine complexen. VE-cadherine heeft een extracellulair domein dat homotypisch interageert met VE-cadherine op aangrenzende endotheelcellen. Het cytoplasmatische domein van VE-cadherine associeert met intracellulaire β- of γ-catenines. Deze VE-cadherine/catenine complexen zijn verbonden met het actine cytoskelet via α-catenine (Fig. 1A). Strakke knooppunten bestaan uit meerdere transmembraaneiwitten, waaronder occludine en claudines 1 en 2, en geassocieerde intracellulaire eiwitten, zoals ZO-1, -2, en -3, die de strakke knooppunt-eiwitten verbinden met het cytoskelet. Van deze twee adhesiejukken heeft het effect van PMN transendotheliale migratie op adherensjukken de meeste aandacht gekregen.

Recente studies met behulp van confocale microscopie blijkt dat PMN kleefstof interacties (adhesie en transendotheliale migratie) kan resulteren in lokale ontwrichting van de adherens junction eiwitten (10). Twee populaties PMN werden gevangen klevend aan endotheelcel monolagen: 1) die waaronder er geen verstoring was van de continuïteit van de adherens junctie-eiwitten en 2) die waaronder er verstoring was van de adherens junctie-eiwitten. De verstoring van de adherens junctie continuïteit door adherente PMN was een lokaal fenomeen, omdat adherens juncties verder weg van de PMN niet werden beïnvloed. Een systematische analyse toonde aan dat adherens junctie-eiwitten onder aanhangend PMN achtereenvolgens werden aangetast, d.w.z. β-catenine ging verloren vóór VE-cadherine. PMN gevangen in het proces van transendotheliale migratie werden steevast geassocieerd met het verlies van alle adherens junctie-eiwitten op de plaats van migratie. Nogmaals, er was geen effect op de adherens junctie integriteit op plaatsen verder verwijderd van de migrerende PMN. Verder zijn er aanwijzingen voor het belang van verstoring van de adherens junctie bij de transendotheliale migratie van PMN, waaronder de volgende: 1) in vivo, antilichamen tegen VE-cadherine verhoogde PMN emigratie, en 2) in vitro, antilichamen tegen VE-cadherine verhoogde PMN transendotheliale migratie en induceerde reorganisatie van endotheliale actine cytoskelet, resulterend in de vorming van gaten tussen endotheliale cellen.

Met betrekking tot tight junction complexen, hebben recente studies soortgelijke waarnemingen gedaan. PMN transendotheliale migratie verstoorde ZO-1 en -2 continuïteit alleen op de plaats van PMN penetratie in de interendotheliale knooppunten (1). Wijdverspreide discontinuïteiten in tight junctions werden niet waargenomen.

Potentiële mechanismen betrokken bij paracellulaire diapedese

Het mechanisme waarmee PMN-endotheliale cel adhesieve interacties de adherens junctie verstoren is onduidelijk. Een mogelijkheid is dat adherente PMN endogene proteasen gebruiken om adherens junctie-eiwitten af te breken (Fig. 1A). Bijvoorbeeld, elastase remmers waren in staat om de mate van PMN-geïnduceerd verlies van de adherens junction eiwitten VE-cadherine en β-catenine te verminderen (2). Andere studies (11) geven aan dat geactiveerde PMN VE-cadherine kunnen degraderen en dat een elastaseremmer deze degradatie kan voorkomen. Bovendien produceert gezuiverd neutrofiel elastase degradatieproducten van VE-cadherine die vergelijkbaar zijn met die welke worden waargenomen na degradatie van deze adherens junction component door geactiveerde PMN. Samen lijkt het waarschijnlijk dat PMN-afgeleide elastase een rol speelt in de verstoring van de adherens junctie.

PMN-endotheliale cel adhesieve interacties zouden ook de endotheliale cellen kunnen signaleren om actief deel te nemen in PMN transendotheliale migratie door zich van elkaar te scheiden, d.w.z. interendotheliale kloofvorming (Fig. 1A). Deze bewering wordt ondersteund door de volgende lijnen van bewijs. Adherente PMN kunnen verhogingen in endotheelcel Ca2+ niveaus induceren, en chelering van dit Ca2+ resulteert in een remming van PMN transendotheliale migratie. Bovendien verminderde remming van endotheliaal myosine licht-keten kinase (een belangrijke determinant van interendotheliale cel gap vorming) de PMN transendotheliale migratie (11). Tenslotte, zoals hierboven vermeld, beïnvloeden adherente PMN het intracellulaire β-catenine voor het plasmamembraan-spannende VE-cadherine. Samen geven deze observaties aan dat endotheelcellen kunnen worden geïnduceerd om actief deel te nemen aan PMN transendotheliale migratie door zich van elkaar terug te trekken.

Aanwijzingen ten gunste van transcellulaire diapedese

Vele vroege en meer recente rapporten die leukocyten diapedese in vivo onderzochten met behulp van een ultrastructurele benadering geven aan dat de meerderheid van PMN’s transcellulair de vasculatuur verlaten, d.w.z, via poriën of doorgangen die het endotheliale cytoplasma doorkruisen. Onderzoek van seriële secties met behulp van transmissie elektronen microscopie suggereren dat PMN’s kunnen migreren door gebieden die niet geassocieerd zijn met identificeerbare cel-cel knooppunten (4, 5, 8). Er is aangevoerd dat zelfs seriële secties niet ondubbelzinnig bewijzen dat een cel-cel kruising niet in de buurt was, maar eerder dat het kan zijn gemist. Bovendien kan het moeilijk zijn om elektron-dense adherens junctions identificeren, met name in die regio’s waar het endotheel is <0,5 urn in hoogte. Ten slotte wijzen recente in vitro gegevens erop dat cel-cel adherens junctions moleculair uiteenvallen tijdens PMN diapedesis (10), en daarom zou men niet verwachten ze morfologisch te zien.

Scanning elektronenmicroscopie beelden leveren meer overtuigend bewijs dat PMN’s endotheelcellen binnendringen door openingen die niet geassocieerd zijn met endotheliale cel-cel contacten (4, 9). PMN’s die zich in het proces van diapedese bevinden, lijken een haltervorm te hebben, met een vernauwing in het gebied ter hoogte van het endotheel (4, 5, 7, 8, 9, 13, 15). Afhankelijk van hoe ver de diapedese gevorderd is, wordt een zeepbelachtige uitbreiding gezien die ofwel in het lumen van het bloedvat uitsteekt, ofwel zich tot in het interstitium uitstrekt (5, 9, 11, 15). Dit wijst erop dat de leukocyten door een cirkelvormige porie met een kleine, beperkte diameter persen in plaats van afzonderlijke endotheelcellen van elkaar te doen terugtrekken. De endotheliale cel en de leukocyt blijven gedurende de diapedese in nauw contact. Het endotheel lijkt zich vaak langs de luminale zijde van het PMN-oppervlak te verspreiden om het volledig op te slokken, waardoor de luminale opening wordt gesloten voordat het PMN in de weefselmatrix wordt losgelaten (4, 5, 8). Dit proces is vaak waargenomen tijdens emigratie in vivo, maar er is niet aangetoond dat het optreedt tijdens transendotheliale migratie in vitro.

Mogelijke mechanismen betrokken bij transcellulaire diapedese

Hoewel het moeilijk is om strikte mechanistische benaderingen toe te passen in in vivo studies, zijn er voldoende indirecte aanwijzingen om verschillende mogelijke mechanismen te ondersteunen waardoor PMN transcellulair emigreren. Het is denkbaar dat de transcellulaire poriën waardoor PMN migreren een gevolg zijn van proteolytische schade aan het endotheel. Er is echter op gewezen dat, althans ultrastructureel, het endotheel onbeschadigd blijft en caveolae en endocytotische vesikels blijft vormen, zelfs in membraangebieden die in nauw contact staan met het PMN (13). Het is waarschijnlijker dat PMN, die over korte afstanden langs het apicale endotheliale oppervlak lijken te migreren, dunne regio’s van het endothelium opzoeken, zoals fenestrae. Fenestrae kunnen open zijn (50 nm in diameter) of begrensd door een diafragma ter dikte van twee plasmamembranen (verstoken van cytoplasma). PMN kunnen dus gemakkelijk door geopende fenestrae passeren of proteolytisch door gediafragmeerde fenestrae passeren zonder het endotheel zelf te beschadigen. Fenestrae kunnen een belangrijke weg zijn voor PMN emigratie in die organen die gefenestreerde microvaten bevatten (b.v. gastro-intestinale mucosa, secretorische klieren).

In organen die continue microvaten bevatten (b.v. huid, spieren), kan het PMN gebruik maken van caveolae of pinocytotic vesicles en daarin filopodia inbrengen om de endotheelbarrière te penetreren. Aangenomen wordt dat deze structuren, met een diameter tussen 50 en 100 nm, het eiwittransport over het endotheel bemiddelen en een extrajunctionele route vormen voor vasculaire eiwitlekkage tijdens ontsteking. Onlangs is aangetoond dat caveolae vesiculo-vacuolaire organellen vormen, die kleine continue membraan-gebonden doorgangen door het cytoplasma van een endotheliale cel kunnen vormen (6). Het is aangetoond dat de vorming van dergelijke caveolae en vesikels doorgaat in endotheliale oppervlaktemembraangebieden die in contact staan met aanhangende PMNs (13). Bovendien, PMNs die zich dicht aan het endotheliale celoppervlak hechten breiden vaak vingerachtige filopodia uit in inkepingen in de apicale plasmamembraan, waardoor het endotheliale oppervlak een nieuwe vorm krijgt (4, 7, 8). De uitsteekkracht van een aanhechtend filopodium in de vorming van vesiculo-vacuolaire organellen kan leiden tot het ontstaan van dit filopodium aan de abluminale endotheelzijde (Fig. 1B), waar het gemakkelijk kan interageren met de extracellulaire matrix en zich daarlangs kan verspreiden (Fig. 1B).

Een concentratie van F-actine en microfilamenten in leidende pseudopodia van PMN is aangetoond tijdens diapedese in vivo (15) en in vitro (3) en kan de kracht genereren die nodig is om voortschrijdende cellulaire processen door de transcellulaire poriën mee te trekken. De poriën kunnen zich verwijden tot een grootte van 3-5 μm, waardoor de leukocyt gemakkelijk kan passeren. Deze verbreding van de initiële vacuolaire porie kan gedeeltelijk tot stand worden gebracht door krachten die worden opgewekt door spanning in het corticale microfilamenteuze systeem dat aanwezig is in het bolvormige deel van de leukocyt dat nog in het lumen van het vat uitsteekt. In feite is een concentratie van F-actine in de caudale regio van transmigrerende PMNs waargenomen tijdens de late stadia van diapedese (15). Bovendien kan cytoskeletale herschikking in het endotheliale cytoplasma helpen bij de verbreding van de transendotheliale porie, zoals eerder is gesuggereerd (14). Het proces van porievorming zou gepaard gaan met een verspreiding van apicale endotheliale membraangebieden langs het PMN celoppervlak, leidend tot de uiteindelijke opslorping van de luminale PMN delen door het endothelium, zoals aangetoond werd in elektronenmicrofoto’s (Fig 1B). Deze actieve deelname van het endotheel zou helpen bij de snelle hersluiting van de endotheliale bekleding, waardoor eiwitlekkage wordt beperkt.

Samenvatting

Uit dit overzicht van het bewijsmateriaal blijkt dat PMN zowel paracellulaire als transcellulaire wegen kunnen gebruiken om de endotheliale barrière tijdens een ontsteking te doorkruisen. Het is de moeite waard erop te wijzen dat PMN transendotheliale migratie in vitro de paracellulaire route prefereert, terwijl PMN transendotheliale migratie in vivo de transcellulaire route prefereert. Als men teleologisch aanneemt dat de transmigrerende PMN de weg van de minste weerstand kiezen, dan kan er een verklaring zijn voor de schijnbare discrepantie tussen de resultaten verkregen met behulp van in vitro en in vivo benaderingen.

In endotheliale cel monolagen gekweekt in cultuur, de meest verzwakte regio’s zijn in de buurt van cel-cel knooppunten, en het is daarom niet verwonderlijk dat dit de voorkeur plaats waar diapedese optreedt. Bovendien zijn in gekweekte endotheelcellen de intercellulaire juncties onstabiele structuren die voortdurend uit elkaar worden gehaald en weer in elkaar worden gezet. Een dergelijk gebied zou gemakkelijk toegankelijk zijn voor de pseudopodia van transmigrerende leukocyten. Er zijn ook aanwijzingen dat, zelfs in vitro, de paracellulaire route die door PMN tijdens diapedese wordt gebruikt specifiek geselecteerd is, d.w.z. dat diapedese bij voorkeur optreedt bij tricellulaire hoeken in plaats van tussen twee endotheelcellen (1). Adherens juncties en tight juncties zijn discontinu bij deze tricellulaire hoeken, en vormen zo de weg van de minste weerstand voor de transmigrerende PMN. De interendotheliale juncties daarentegen zijn in vivo veel beter ontwikkeld en bieden meer weerstand tegen de verplaatsing van eiwitten over deze juncties. Aldus kan het PMN bij voorkeur poriën in het dunne gebied van de endotheelcellen, zoals fenestrae of caveolae, gebruiken als de weg van de minste weerstand.

De voorkeurspad (paracellulair vs. transcellulair) gebruikt door PMN tijdens diapedese toeschrijven aan het feit of in vitro of in vivo benaderingen werden gebruikt om dit fenomeen te bestuderen is, met name, een oversimplificatie. Er zijn talrijke voorbeelden van afwijkingen van dit paradigma. Er zijn bijvoorbeeld aanwijzingen dat PMN in vivo de paracellulaire weg en in vitro de transcellulaire weg kunnen gebruiken. Bovendien, als de transcellulaire route de voorkeursroute is voor PMN diapedese in vivo, waarom verandert interferentie met junctionele eiwitten de PMN diapedese in vivo dan dramatisch? Het is goed mogelijk dat deze discussie nog jaren zal voortduren, net als de discussie over de vraag of transendotheliale eiwitverplaatsing bij voorkeur plaatsvindt via de paracellulaire of de transcellulaire route. Men kan zich voorstellen dat de argumenten betreffende de route van transendotheliale migratie van PMN, gedeeltelijk, kunnen toegeschreven worden aan de aard van de ontstekingsreactie of aan de aard van het vaatbed waarin ze optreedt. Hopelijk zullen verdere studies bijkomende informatie opleveren die de oplossing van deze controverse mogelijk zal maken.