Identification and characterization of a novel botulinum neurotoxin

Searching genomic databases revealed a novel BoNT gene

In a attempt to survey the evolutionary landscape of BoNTs, we performed iterative Hidden Markov model searches of the Uniprot sequence database. Onze zoekactie identificeerde alle bekende BoNT subtypes en mozaïek toxines, evenals het verwante tetanus neurotoxine (Fig. 1a; Supplementary Fig. 1). Tot onze verrassing bracht de zoekactie een potentieel nieuwe BoNT aan het licht, voorlopig aangeduid als BoNT/X (Fig. 1a, GenBank no.: BAQ12790.1), afkomstig van de recent gerapporteerde genomische sequentie van C. botulinum stam 111. BoNT/X vertoonde de minste eiwit-sequentie-identiteit met de andere BoNTs in paarsgewijze vergelijkingen (Fig. 1b). Bovendien is de lage sequentie-identiteit gelijkmatig verdeeld over de volledige BoNT/X-sequentie (fig. 1c), wat erop wijst dat het geen mozaïektoxine is. Ondanks deze lage sequentie-identiteit, is de algemene domein-indeling van BoNTs geconserveerd in BoNT/X (Fig. 1c), inclusief een zink-afhankelijk protease motief HEXXH (residuen 227-231, HELVH) in de LC (ref. 33), en een SXWY motief in de HC (residuen 1,274-1,277, SAWY), dat de lipide receptor gangliosiden herkent34.

(a) Een fylogenetisch opgesplitst netwerk dat alle BoNT-serotypes, subtypes, mozaïektoxines en het verwante tetanusneurotoxine (TeNT) omvat, illustreert hun mogelijke evolutionaire verwantschappen, alsook conflicten als gevolg van bv. chimerismen, op basis van hun eiwitsequenties. BoNT/X is in rood aangegeven. Een vergrote versie van dit paneel is te zien in supplementaire fig. 1, met het sequentie toegangsnummer voor elk toxinegen genoteerd. (b) Een fylogenetische boom van de eiwitsequentie-uitlijning voor BoNT/A-G, TeNT en BoNT/X, geanalyseerd met de ClustalW-methode. De percentages van sequentie-identiteit tussen elk toxine en BoNT/X zijn genoteerd. (c) Bovenste paneel: schematische tekening van de drie domeinen van BoNT/X, met vermelding van het geconserveerde proteasemotief in de LC en het gangliosidebindende motief in de HC. Onder: analyse met behulp van een glijdend sequentievergelijkingsvenster toont aan dat de lage overeenkomst tussen BoNT/X en andere BoNTs/TeNT gelijkmatig verdeeld is over de gehele BoNT/X sequentie. De X-as geeft de positie van de query-sequentie in het midden van een 100-amino-acid bewegend sequentie-vergelijkingsvenster. De Y-as toont het percentage van de identiteit tussen dat sequentie-venster en elk van de uitgelijnde achtergrond sequenties. De twee balken bovenaan de grafiek illustreren de best passende sequentie (onderste balk) en of de beste overeenkomst significant gescheiden is van de op één na beste overeenkomst (bovenste balk). (d) Een schematische tekening van de orf-gencluster die gastheer is van het BoNT/X-gen (bovenste paneel), die twee duidelijke kenmerken heeft in vergelijking met andere bekende orfX-clusters (middelste en onderste panelen): (1) er is een extra orfX2-eiwit (aangeduid als orfX2b) naast het BoNT/X-gen; (2) het leesraam van orfX-genen heeft dezelfde richting als het BoNT/X-gen.

Zoals de andere BoNT’s bevindt het BoNT/X-gen zich in een gencluster23. Alle zeven vastgestelde BoNT’s worden gecoëxpresseerd met een ander 150 kDa-eiwit dat bekend staat als NTNHA (niet-toxisch niet-hemagglutinine-eiwit), dat een pH-afhankelijk complex vormt met BoNT’s en hen beschermt tegen proteasen in het maagdarmkanaal35. Het BoNT/X gen wordt ook voorafgegaan door een potentieel NTNHA gen (Fig. 1d). Naast BoNT en NTNHA bevat een typische BoNT-gencluster genen die coderen voor één van de twee soorten accessoire proteïnen: (1) de HA-cluster die codeert voor drie geconserveerde eiwitten HA17, HA33 en HA70, die een complex vormen met BoNT/NTNHA en de absorptie van toxinen over de intestinale epitheliale barrière vergemakkelijken36,37,38; of (2) de OrfX-cluster die codeert voor geconserveerde OrfX1, OrfX2, OrfX3 en P47-eiwitten met onbekende functie23. Het BoNT/X-gen bevindt zich in een OrfX-gencluster, evenals BoNT/E, F en leden van BoNT/A. Interessant is dat de BoNT/X cluster twee unieke kenmerken heeft (Fig. 1d): (1) er is een bijkomend OrfX2 gen dat in geen enkele andere BoNT cluster bestaat (we hebben het OrfX2b genoemd); (2) het leesframe van OrfX genen is gewoonlijk tegengesteld aan BoNT/NTNHA genen, maar het heeft dezelfde richting als het BoNT/X gen in de BoNT/X cluster (Fig. 1d). Deze bevindingen suggereren dat BoNT/X een unieke tak van de BoNT familie is.

De LC van BoNT/X klieft VAMP2 op een nieuwe plaats

Om BoNT/X te karakteriseren, richtten we ons eerst op zijn LC (X-LC, residuen 1-439) en produceerden het als een His6-tagged eiwit in Escherichia coli. LCs van BoNT/A (A-LC) en BoNT/B (B-LC) werden geproduceerd en in parallel getest als controles. Incubatie van X-LC met rat hersenen detergent extracten (BDE) had geen invloed op syntaxine 1 of SNAP-25, maar afgeschaft VAMP2 immunoblot signalen (Fig. 2a). LC’s van BoNTs zijn zink-afhankelijke proteasen33. Zoals verwacht, verhinderde EDTA splitsing van SNARE eiwitten door X-, A- en B-LCs (Fig. 2a). Bovendien zette incubatie van X-LC met het gezuiverde recombinante cytosolische domein van VAMP2 (residuen 1-93) VAMP2 om in twee banden met een lager molecuulgewicht (Fig. 2b), wat bevestigt dat X-LC VAMP2 splitst.

(a) X-LC werd geïncubeerd met BDE. Immunoblotanalyse werd uitgevoerd om syntaxine 1, SNAP-25 en VAMP2 op te sporen. Synaptofysine (Syp) diende als laadcontrole. A-LC en B-LC werden parallel geanalyseerd. Splitsing van VAMP2 door B-LC leidt tot verlies van immunoblot-signalen, terwijl splitsing van SNAP-25 door A-LC een kleiner fragment genereert (aangegeven met een asterisk). EDTA blokkeerde de activiteit van X-, A- en B-LCs. (b) VAMP2 (1-93) werd geïncubeerd met X-LC. De monsters werden geanalyseerd met SDS-PAGE en Coomassieblauwkleuring. X-LC zette VAMP2 (1-93) om in twee kleinere fragmenten. (c-e) VAMP2 (1-93) werd geïncubeerd met X-LC. De monsters werden geanalyseerd met massaspectrometrie (LC-MS/MS) om het molecuulgewicht van de gesplitste fragmenten te bepalen. De geëlueerde peptidepieken van de HPLC-kolom zijn uitgezet tegen de looptijd (RT, X-as). De massaspectrometriegegevens voor de twee splitsingsproducten worden met kleur gecodeerd, waarbij de verhouding massa/lading (m/z) wordt genoteerd. Het molecuulgewicht wordt afgeleid door vermenigvuldiging van m met z, gevolgd door aftrek van z. De eiwitsequenties voor de twee splitsingsproducten zijn met kleur gecodeerd en staan vermeld in c. (f) Sequentiealignering tussen VAMP-familieleden, met de splitsingsplaatsen voor BoNT/B, D, F, G en X in rood aangegeven, en de twee SNARE-motieven in blauwe schaduw. (g) HA-gemerkte VAMP1, 3, 7 en 8, en Myc-gemerkte Sec22b en Ykt6 werden in 293T cellen tot expressie gebracht via transiënte transfectie. Cellysaten werden geïncubeerd met X-LC en onderworpen aan immunoblotanalyse. Actine is een laadcontrole. (h) GST-tagged Ykt6 werd geïncubeerd met X-LC (100 nM). De monsters werden geanalyseerd met SDS-PAGE en Coomassieblauwkleuring. (i) GST-getagd VAMP2 (33-86), VAMP4 (1-115) en VAMP5 (1-70) werden geïncubeerd met X-LC (100 nM). De monsters werden geanalyseerd met SDS-PAGE en Coomassieblauwkleuring. X-LC kliefde zowel VAMP4 als VAMP5. We merken op dat het VAMP5-eiwit een verontreinigende band bevat die dicht bij het splitsingsproduct loopt. (j) Experimenten werden uitgevoerd als beschreven in a, behalve dat VAMP4 en Sec22b werden gedetecteerd. Synaptotagmin I (Syt I) is een laadcontrole. X-LC gesplitst natieve VAMP4 in BDE. Een van twee (b,g,j) of drie (a,h,i) onafhankelijke experimenten wordt getoond.

Om de splitsingsplaats te identificeren, analyseerden we het VAMP2 (1-93) eiwit, met of zonder pre-incubatie met X-LC, met vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS, Fig. 2c-e). Een enkele dominante peptidepiek verscheen na incubatie met X-LC (Fig. 2c,e; Supplementaire Fig. 2). Het molecuulgewicht is 3.081,7, wat alleen past bij de peptidevolgorde van A67-L93 van VAMP2 (Fig. 2c,e). Dienovereenkomstig werd ook een ander fragment van het begin van de His6-tag tot residu R66 van VAMP2 gedetecteerd (Fig. 2d). Om deze bevinding verder te bevestigen, herhaalden we de assay met een ander VAMP2 fragment: glutathione S-transferase (GST) getagged VAMP2 (33-86) (Supplementary Fig. 3). Incubatie met X-LC genereerde een enkele dominante peptidepiek met een molecuulgewicht van 2.063,1, die alleen past bij A67-R86 van VAMP2 (supplementaire fig. 3). Samen tonen deze resultaten aan dat X-LC een enkele splitsingsplaats op VAMP2 heeft tussen R66 en A67.

R66-A67 is een nieuwe splitsingsplaats op VAMP2, verschillend van alle gevestigde doelplaatsen van BoNTs (Fig. 2f). Het is ook de enige BoNT splitsingsplaats gelegen binnen een regio die voorheen bekend stond als het SNARE motief (Fig. 2f, gearceerde gebieden)39. De VAMP proteïne familie omvat VAMP1, 2, 3, 4, 5, 7 en 8, alsook de verwante Sec22b en Ykt6. R66-A67 is geconserveerd in VAMP1 en 3, die sterk homoloog zijn aan VAMP2. Om de specificiteit van X-LC te valideren, brachten we HA-tagged VAMP1, 3, 7, 8 en Myc-tagged Sec22b en Ykt6 tot expressie in HEK293 cellen via transiënte transfectie. Cellysaten werden geïncubeerd met X-LC. Zowel VAMP1 als 3 werden door X-LC gekliefd, terwijl VAMP7, VAMP8 en Sec22b resistent waren tegen X-LC (Fig. 2g).

BoNT/X klieft VAMP4, VAMP5 en Ykt6

Onverwacht werd Ykt6 ook door X-LC gekliefd (Fig. 2g). Deze bevinding werd bevestigd met behulp van een gezuiverd GST-getagd Ykt6 fragment, dat verschoof naar een band met een lager moleculair gewicht na incubatie met X-LC (Fig. 2h). De splitsingsplaats werd vastgesteld op K173-S174 door massaspectrometrie analyse van de intacte Ykt6 versus Ykt6 gesplitst door X-LC (Supplementary Fig. 4). Deze plaats is homoloog aan de splitsingsplaats van BoNT/X op VAMP2 (Fig. 2f). Onder de VAMP familie van eiwitten, bevat VAMP4 hetzelfde paar residuen (K87-S88) op deze plaats als Ykt6. We ontdekten dat X-LC zowel gezuiverd GST-getagd cytoplasmatisch domein van VAMP4 splitste (Fig. 2i), als natief VAMP4 in BDE (Fig. 2j). Als controle werd Sec22b niet door X-LC in BDE gesplitst. Bovendien werd het cytoplasmatische domein van VAMP5, voorzien van een GST-tag, ook gesplitst (Fig. 2i). De splitsingsplaatsen werden door massaspectrometrie-analyse bepaald op K87-S88 in VAMP4 en R40-S41 in VAMP5 (supplementaire Fig. 5). Beide sites zijn homoloog met de splitsingsplaats van BoNT/X op VAMP2 (Fig. 2f), wat aantoont dat de locatie van de splitsingsplaats geconserveerd is tussen verschillende VAMPs. Het vermogen van X-LC om VAMP4, VAMP5 en Ykt6 te klieven is hoogst ongebruikelijk, aangezien hun sequenties aanzienlijk verschillen van die van VAMP1/2/3. BoNT/X is de eerste en enige bekende BoNT die VAMPs kan klieven buiten de canonieke doelwitten VAMP1, 2 en 3 (ref. 40).

Proteolytische activering van BoNT/X

Wij onderzochten vervolgens de linker regio tussen de LC en de HC, die moet worden gekliefd door bacteriële of gastheerproteasen om het toxine om te zetten in een ‘actieve’ di-ketenvorm. We produceerden een recombinant X-LC-HN fragment (residuen 1-891) in E. coli en onderwierpen het aan beperkte proteolyse door endoproteïnase Lys-C. De monsters werden geanalyseerd met behulp van Tandem Mass Tag (TMT) labeling en tandem massaspectrometrie. TMT labelt vrije N-termini (en lysines). Beperkte proteolyse door Lys-C leverde één nieuwe vrije N-terminus op, gekoppeld aan residu N439 in de linkerregio (fig. 3a; aanvullende gegevens 1), waarmee wordt bevestigd dat de linkerregio gevoelig is voor proteasen.

(a) Sequentiealignering van de linker tussen de LC en HC van de zeven bekende BoNTs plus BoNT/X. De Lys-C-snijplaats is geïdentificeerd door massaspectrometrieanalyse (zie methode en aanvullende gegevens 1). (b) Gekweekte corticale neuronen van ratten werden gedurende 12 uur blootgesteld aan X-LC-HN. Cellysaten werden geoogst en immunoblotanalyse werd uitgevoerd om syntaxine 1, SNAP-25 en VAMP2 te onderzoeken. Actine is een laadcontrole. Trypsine-geactiveerde A-LC-HN en B-LC-HN werden parallel geanalyseerd. X-LC-HN ging neuronen binnen en kliefde VAMP2. X-LC-HN geactiveerd door Lys-C vertoonde een grotere potentie dan niet-geactiveerd X-LC-HN. X-LC-HN was krachtiger dan B-LC-HN en A-LC-HN, die geen van beide hun substraat splitsten. (c) WT en gemuteerde X-LC-HN werden geactiveerd door Lys-C en geanalyseerd met SDS-PAGE en Coomassieblauwkleuring, met of zonder DTT. De C461S- en C467S-mutanten vertoonden zonder DTT een enkele band van ∼100 kDa, die met DTT in twee ∼50 kDa-banden uiteenviel. Een deel van WT X-LC-HN vormde aggregaten, gemarkeerd met een asterisk, die met DTT verdwenen. Het merendeel van de geactiveerde WT X-LC-HN scheidde zich in twee ∼50 kDa-banden zonder DTT. Dit is het gevolg van disulfidebinding shuffling zoals beschreven in het volgende paneel. (d) Lys-C-geactiveerde WT X-LC-HN werd geïncubeerd met NEM om disulfidebinding-shuffling te blokkeren. De monsters werden vervolgens geanalyseerd met SDS-PAGE en Coomassieblauwkleuring. Een meerderheid van WT X-LC-HN bestaat als een enkele band bij ∼100 kDa zonder DTT na NEM-behandeling, wat erop wijst dat natieve WT X-LC-HN een inter-keten disulfidebinding bevat. (e) Schematische tekeningen van de disulfidebinding in WT en drie cysteïnemutanten van BoNT/X. (f) Experimenten werden uitgevoerd zoals beschreven in b, behalve dat neuronen werden blootgesteld aan WT of X-LC-HN mutanten. De C423S-mutatie elimineerde de activiteit van X-LC-HN, terwijl de mutatie van C461 of C467 geen invloed had op de activiteit van X-LC-HN. Deze resultaten bevestigden dat de inter-keten disulfidebinding essentieel is voor de activiteit van X-LC-HN, en dat deze inter-keten disulfidebinding kan worden gevormd via C423-C461 of C423-C467. Een van twee (b) of drie (b,c,f) onafhankelijke experimenten wordt getoond.

Wij hebben vervolgens onderzocht of proteolytische activering de potentie van BoNT/X verhoogt. Het is aangetoond dat incubatie van hoge concentraties LC-HN van BoNTs met gekweekte neuronen resulteert in binnenkomst van LC-HN, waarschijnlijk door niet-specifieke opname in neuronen41. Op dezelfde manier kwam X-LC-HN gekweekte rat corticale neuronen binnen en splitste VAMP2 op een concentratie-afhankelijke manier (Fig. 3b). Activering door Lys-C verhoogde de potentie van X-LC-HN: 10 nM geactiveerd X-LC-HN splitste vergelijkbare hoeveelheden VAMP2 als 150 nM intact X-LC-HN (fig. 3b). Geactiveerde X-LC-HN blijkt krachtiger te zijn dan geactiveerde LC-HN van BoNT/A (A-LC-HN) en BoNT/B (B-LC-HN), die geen detecteerbare splitsing van hun substraten vertoonden onder dezelfde testomstandigheden (Fig. 3b).

De inter-keten disulfide binding in BoNT/X

Zoals andere BoNTs, bevat de linker regio van BoNT/X twee geconserveerde cysteïnen, maar er is ook een extra cysteïne (C461) uniek voor BoNT/X (Fig. 3a). Om de cysteïneresiduen te bepalen die de essentiële inter-keten disulfidebinding vormen, genereerden we drie X-LC-HN mutanten, waarbij elk van de drie cysteïneresiduen gemuteerd is (C423S, C461S en C467S). Deze mutanten en het wild-type (WT) X-LC-HN werden onderworpen aan een beperkte proteolyse met Lys-C en vervolgens geanalyseerd via SDS-PAGE en Coomassieblauwkleuring, met of zonder het reductiemiddel dithiothreitol (DTT; Fig. 3c). Mutatie van de enige cysteïne op de LC (C423S) zal naar verwachting de disulfidebinding tussen de ketens opheffen. De C423S-mutant scheidde zonder DTT consequent in twee ∼50 kDa-banden. Daarentegen vertoonden zowel C461S- als C467S-mutanten bij afwezigheid van DTT één band bij 100 kDa en scheidden zij zich bij aanwezigheid van DTT in twee ∼50 kDa-banden. Deze resultaten suggereerden dat C423 op de LC de inter-keten disulfide binding kan vormen met ofwel C461 of C467 op de HC. We vonden ook dat Lys-C behandeling een aanzienlijk deel van de C423S mutant afbrak in vergelijking met C461S of C467S mutanten (Fig. 3c, +DTT), wat suggereert dat het verlies van de inter-keten disulfide binding het molecuul vatbaarder maakt voor proteasen. We zagen dat een deel van WT X-LC-HN aggregaten vormde aan de bovenkant van de SDS-PAGE-gel (Fig. 3c, gemarkeerd met een asterisk). Deze aggregaten verdwenen in aanwezigheid van DTT. C423/C461/C467 zijn de enige drie cysteïnen in het X-LC-HN; door mutatie van een van deze werd de vorming van aggregaten opgeheven (Fig. 3c, -DTT), wat suggereert dat deze aggregaten worden gevormd door inter-moleculaire disulfidebindingen als gevolg van het bestaan van een extra cysteïne in het linkergebied.

Interessant is dat de meerderheid van de geactiveerde WT X-LC-HN zich scheidde in twee ∼50 kDa banden zonder DTT (Fig. 3c), wat vergelijkbaar is met de C423S mutant. Anderzijds vertoonde WT X-LC-HN geen verhoogde afbraak door Lys-C vergeleken met C423S-mutant (Fig. 3c, +DTT). Een mogelijke verklaring is dat WT X-LC-HN onder natieve omstandigheden een disulfidebinding tussen de ketens bevat, maar dat deze binding zich onder denaturerende omstandigheden in de SDS-buffer kan herschikken tot een C461-C467-paar binnen de keten. Dit fenomeen staat bekend als disulfidebinding shuffling, die vaak optreedt tussen aangrenzende cysteïnen. Om deze hypothese te testen, gebruikten wij een alkylerend reagens, N-Ethylmaleimide (NEM), dat permanent vrije cysteïnen blokkeert en disulfidebindingverschuiving voorkomt. Zoals te zien is in Fig. 3d, vertoonde WT X-LC-HN voorbehandeld met NEM een enkele band bij 100 kDa in afwezigheid van DTT, en scheidde zich in twee ∼50 kDa banden in aanwezigheid van DTT. Deze resultaten bevestigen dat WT X-LC-HN voornamelijk een inter-keten disulfide binding bevat, maar het is gevoelig voor disulfide binding shuffling als gevolg van een extra cysteïne in de linker regio (Fig. 3e).

We onderzochten verder de activiteit van de drie X-LC-HN cysteïne mutanten op gekweekte neuronen. Zoals verwacht was de C423S mutant inactief, terwijl de C461S en C467S mutanten beide een vergelijkbare activiteit vertoonden als WT X-LC-HN (Fig. 3f). Deze resultaten bevestigen dat de inter-chain disulfide binding cruciaal is voor de activiteit van BoNT/X.

Het genereren van full-length BoNT/X via sortase-gemedieerde ligatie

We probeerden vervolgens te bepalen of full-length BoNT/X een functioneel toxine is. Aangezien er geen antisera tegen BoNT/X beschikbaar zijn, hebben we besloten om het genereren van het volledige actieve toxinegen te vermijden. In plaats daarvan ontwikkelden we een aanpak om een beperkte hoeveelheid full-length BoNTs in reageerbuisjes te genereren door enzymatische ligatie van twee niet-toxische fragmenten van BoNTs. Deze methode maakt gebruik van een transpeptidase bekend als sortase42,43, die het peptidemotief LPXTG herkent, splijt tussen T-G, en gelijktijdig een nieuwe peptidebinding vormt met andere eiwitten/peptiden die N-terminale glycine bevatten (Fig. 4a). Wij produceerden twee niet-toxische fragmenten van BoNT/X: (1) LC-HN met een LPETGG motief en een His6-tag gefuseerd aan de C terminus; en (2) de HC van BoNT/X (X-HC) met een GST tag, trombine splitsingsplaats, en een extra glycine residu aan de N terminus. Snijden door trombine geeft X-HC met een vrije glycine aan de N-terminus. Incubatie van deze twee fragmenten met sortase genereerde een kleine hoeveelheid ∼150 kD full-length BoNT/X (X-FL, Fig. 4a,b). We merken op dat X-HC slechte oplosbaarheid en een sterke neiging tot aggregatie vertoonde, wat de reden zou kunnen zijn voor de lage ligatie efficiëntie (Fig. 4b). In tegenstelling, ligatie van X-LC-HN met de HC van BoNT / A (A-HC) een betere efficiëntie bereikt, met de meerderheid van X-LC-HN geligeerd in een XA chimere toxine (Supplementaire Fig. 6a). Om de bioveiligheid te waarborgen, is de hoeveelheid precursorfragmenten in de reactie strikt beperkt tot de minimale hoeveelheid geligeerd toxine die nodig is voor functionele assays.

(a) Een schematische tekening van de sortase ligatie methode. (b) De reactiemengsels van sortase ligatie werden geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE en Coomassieblauwkleuring. De asterisk markeert de eiwitaggregaten ten gevolge van intermoleculaire disulfidebindingen. Volgroeide BoNT/X (X-FL) verscheen alleen in het sortase ligatiemengsel. (c) Neuronen blootgesteld aan het sortase ligatiemengsel (15 pi) of controlemengsels gedurende 12 uur in kweekmedium. Cellysaten werden geanalyseerd door immunoblot. Het mengsel met zowel X-LC-HN en X-HC (maar niet sortase) gekliefd iets meer VAMP2 dan X-LC-HN alleen. Ligering van X-LC-HN en X-HC met sortase versterkte de splitsing van VAMP2, waaruit blijkt dat geligeerd X-FL functioneel is op neuronen. (d) BoNT / A-G, BoNT / DC en BoNT / X werden onderworpen aan de dot blot assay, met behulp van vier paard antisera (driewaardige anti-BoNT / A, B en E, anti-BoNT / C, anti-BoNT / DC en anti-BoNT / F), evenals twee geit antisera (anti-BoNT / G en anti-BoNT / D). BoNT/X is samengesteld uit X-LC-HN en X-HC in een molaire verhouding van 1:1. Deze antisera herkenden hun overeenkomstige doeltoxinen, maar geen enkel herkende BoNT/X. De antisera tegen BoNT/DC en BoNT/C vertonen een kruisreactie, aangezien deze twee toxinen een hoge mate van overeenkomst vertonen binnen hun HC-domeinen. (e) Gekweekte corticale neuronen van ratten werden blootgesteld aan geligeerd X-FL in kweekmedium gedurende 12 uur, met of zonder twee combinaties van anti-sera. Ab1: driewaardige anti-BoNT/A/B/E, anti-BoNT/C en anti-BoNT/F. Ab2: anti-BoNT/G en anti-BoNT/D. De driewaardige anti-BoNT/A/B/E werd gebruikt in een verdunning van 1:50. Alle andere antisera werden gebruikt in een verdunning 1:100. Geen van de antisera beïnvloedde de splitsing van VAMP2 en VAMP4 door X-FL. De specificiteit en werkzaamheid van deze antisera werden gevalideerd voor hun vermogen om doelserotypen te neutraliseren in dezelfde assay als beschreven in aanvullende fig. 7. (f) X-FL gekoppeld door sortase reactie (0,5 ug) werd geïnjecteerd in de gastrocnemius spieren van de rechter achterpoot van muizen (n = 4). De geïnjecteerde ledemaat ontwikkelde typische slappe verlamming, en de tenen niet te spreiden binnen 12 h. De linker ledemaat werd niet geïnjecteerd met toxines, die diende als een controle. (g) De volledige inactieve vorm van BoNT/X (BoNT/XRY) werd gezuiverd als een His6-getagd recombinant eiwit in E. coli. Verder gezuiverd BoNT/XRY wordt getoond in aanvullende Fig. 8b. Een van twee (e) of drie (c,d) onafhankelijke experimenten wordt getoond.

We analyseerden eerst de activiteit van geligeerde BoNT/X met behulp van gekweekte rat corticale neuronen. Neuronen werden blootgesteld aan de sortase ligatie mengsel en controle mengsels in kweekmedium. Zoals in fig. 4c te zien is, kliefde X-LC-HN alleen wat VAMP2 door de hoge concentratie in het reactiemengsel. Menging van X-HC met X-LC-HN zonder sortase versterkte de splitsing van VAMP2 enigszins ten opzichte van X-LC-HN alleen, wat suggereert dat X-HC via niet-covalente interacties met X-LC-HN geassocieerd zou kunnen zijn. Deze interactie lijkt specifiek te zijn, zoals mengen A-HC met X-LC-HN niet cleavage van VAMP2 in neuronen (Supplementary Fig. 6b) te verbeteren. Ligeren X-LC-HN met X-HC door sortase duidelijk verbeterd splitsing van VAMP2 in vergelijking met het mengsel van X-LC-HN en X-HC zonder sortase (Fig. 4c). Deze resultaten toonden aan dat de X-HC functioneel is voor het richten van cellen en dat geligeerd full-length BoNT/X neuronen binnendrong en VAMP2 kliefde. Op dezelfde manier ging geligeerd XA ook neuronen binnen en kliefde VAMP2 (Supplementaire Fig. 6b).

BoNT/X werd niet herkend door antisera tegen bekende BoNTs

We voerden vervolgens dot blot assays uit met antisera tegen bekende BoNTs, waaronder alle zeven serotypes en een mozaïektoxine (BoNT/DC), om te bevestigen dat BoNT/X serologisch uniek is. Vier paardenantisera werden gebruikt (driewaardige anti-BoNT/A, B en E, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC, en anti-BoNT/F), alsook twee geitenantisera (anti-BoNT/G en anti-BoNT/D). De specificiteit en de werkzaamheid van deze antisera werden eerst gevalideerd door het analyseren van hun vermogen om BoNTs te neutraliseren op gekweekte neuronen. Zoals verwacht neutraliseerden alle antisera hun doel-BoNTs, zonder de activiteit van een ander serotype te beïnvloeden (supplementaire Fig. 7). We vonden dat deze antisera hun overeenkomstige BoNTs in de dot blot assay herkenden, maar geen herkende BoNT/X (Fig. 4d).

We analyseerden verder of de toxiciteit van BoNT/X op neuronen door deze antisera kan worden geneutraliseerd. X-FL gegenereerd door sortase-gemedieerde ligatie werd eerst geactiveerd met beperkte proteolyse met trypsine. We gebruikten trypsine om X-FL te activeren in plaats van Lys-C voor functionele assays, omdat trypsine ons in staat stelt proteolyse te stoppen met behulp van trypsine-remmers. Geactiveerde X-FL ging gekweekte rat corticale neuronen en gesplitst zowel VAMP2 en VAMP4 in een concentratie-afhankelijke wijze (Fig. 4e). Combinaties van antisera tegen bekende BoNTs (Ab1 (paardenantisera): driewaardige anti-BoNT/A, B en E, anti-BoNT/C, en anti-BoNT/F; Ab2 (geitenantisera): anti-BoNT/G en anti-BoNT/D) hadden geen invloed op de activiteit van geligeerd X-FL, zoals blijkt uit vergelijkbare mate van VAMP2 en VAMP4 splitsing in de aanwezigheid van deze antisera (Fig. 4e). Deze resultaten bevestigden dat BoNT/X een nieuw BoNT serotype is.

BoNT/X induceerde slappe verlamming in vivo in muizen

We probeerden vervolgens te bepalen of BoNT/X actief is in vivo met behulp van een gevestigde niet-dodelijke assay in muizen, bekend als de Digit Abduction Score (DAS) assay, die lokale spierverlamming meet na injectie van BoNTs in spieren van de achterpoot van muizen44. BoNTs veroorzaken slappe verlamming van de spieren van de ledematen, wat tot uiting komt in het onvermogen om de tenen te spreiden in antwoord op een startprikkel. We injecteerden geligeerd X-FL (0,5 ug, geactiveerd door trypsine behandeling) in de gastrocnemius spieren van de rechter achterpoot van muizen, die typische slappe verlamming en het falen van de tenen te spreiden (Fig. 4f) geïnduceerd, wat aangeeft dat BoNT / X is in staat om slappe verlamming in vivo te veroorzaken. We merken op dat de potentie van geligeerd X-FL veel lager lijkt te zijn dan die van andere BoNTs in deze test. Om de lage toxiciteit van geligeerd X-FL verder te bevestigen, injecteerden we muizen met 1 μg geligeerd X-FL intraperitoneaal (n=3). Geen van de muizen vertoonde systemische effecten en ze overleefden allemaal bij deze dosis. Dus, geligeerde X-FL heeft een vrij lage toxiciteit in vivo bij muizen in vergelijking met andere natieve BoNTs, die meestal dodelijke doses hebben bij lage picogram niveaus per muis.

Full-length inactieve BoNT/X

Finitief, ontwikkelden we een inactieve mutant van BoNT/X als een potentieel reagens voor het genereren van neutraliserende antilichamen. Mutaties op twee residu’s (R362A/Y365F) in BoNT/A inactiveren de protease activiteit van de LC en heffen de toxiciteit van BoNT/A in vivo op45,46. Deze twee residuen zijn geconserveerd in BoNT/X. We introduceerden de overeenkomstige mutaties (R360A / Y363F) in BoNT / X en genereerde een full-length inactieve vorm, aangeduid als BoNT / XRY. Zoals getoond in Fig. 4g, werd BoNT/XRY gezuiverd als een His6-getagd eiwit in E. coli, en het had geen activiteit op gekweekte neuronen (Supplementary Fig. 8a). Bovendien intraperitoneale injectie van muizen met 30 ug BoNT / XRY (geactiveerd door trypsine behandeling) heeft geen nadelige effecten (n = 5), waaruit blijkt dat het niet giftig is in vivo. Een aanzienlijk deel van BoNT / XRY gevormd aggregaten aan de bovenkant van de SDS-PAGE gel (Fig. 4g). Toevoeging van DTT verminderde deze aggregaten tot monomere BoNT/XRY (Fig. 4g). Dus, full-length BoNT/X is gevoelig voor het vormen van inter-moleculaire disulfidebindingen. Niettemin kan de monomere vorm van BoNT/X worden gezuiverd en is stabiel in oplossing (Fig. 4g). Bovendien ontwikkelden we een scale-up zuiveringsprotocol, die BoNT / XRY gegenereerd met een opbrengst van ∼3 mg per liter van de cultuur en ∼90% zuiverheid (Supplementary Fig. 8b). Sterk gezuiverde BoNT / XRY bleef stabiel in oplossing tot 10 mg ml-1 in aanwezigheid van reductiemiddel. Deze atoxische BoNT/XRY zal een waardevol reagens zijn voor het genereren van neutraliserende antilichamen.