Holliday junction

De twee routes voor homologe recombinatie bij eukaryoten, die de vorming en oplossing van Holliday junctions laten zien

De Holliday junction is een belangrijk tussenproduct bij homologe recombinatie, een biologisch proces dat de genetische diversiteit vergroot door genen tussen twee chromosomen te verschuiven, en bij plaatsspecifieke recombinatie waarbij integrases betrokken zijn. Zij zijn ook betrokken bij het herstel van dubbelstrengsbreuken. Bovendien kunnen kruisvormige structuren met Holliday-juncties ontstaan om de spiraalvormige spanning in symmetrische sequenties in DNA-supercoils te verlichten. Hoewel vier-armige juncties ook voorkomen in functionele RNA moleculen, zoals U1 spliceosomaal RNA en het haarspeld ribozym van het tabaksringpotvirus, bevatten deze meestal ongepaarde nucleotiden tussen de gepaarde dubbelhelixale domeinen, en nemen dus niet strikt de Holliday structuur over.

De Holliday juncties in homologe recombinatie bevinden zich tussen identieke of bijna identieke sequenties, wat leidt tot een symmetrische rangschikking van sequenties rond de centrale junctie. Hierdoor kan een takmigratieproces optreden waarbij de strengen door het knooppunt bewegen. Splitsing, of oplossing, van de Holliday junctie kan op twee manieren plaatsvinden. Splitsing van de oorspronkelijke reeks strengen leidt tot twee moleculen die genconversie kunnen vertonen maar geen chromosomale crossover, terwijl splitsing van de andere reeks van twee strengen ertoe leidt dat de resulterende recombinante moleculen crossover vertonen. Alle producten, ongeacht de splitsing, zijn heteroduplexen in het gebied van de Holliday junction migratie.

Veel eiwitten zijn in staat om de Holliday junction structuur te herkennen of te vervormen. Een van deze klassen omvat junctie-oplossende enzymen die de juncties splijten, soms op een sequentiespecifieke manier. Dergelijke eiwitten vervormen de structuur van de Holliday junctie op verschillende manieren, vaak door de junctie in een ongestapelde conformatie te trekken, de centrale basenparen te breken en/of de hoeken tussen de vier armen te veranderen. Andere klassen zijn takmigratie-eiwitten die de uitwisselingssnelheid met ordes van grootte verhogen, en plaatsspecifieke recombinases. Bij prokaryoten vallen de Holliday junction resolvases uiteen in twee families, integrases en nucleases, die elk structureel vergelijkbaar zijn, hoewel hun sequenties niet geconserveerd zijn.

In eukaryoten zijn twee primaire modellen voor hoe homologe recombinatie dubbelstrengsbreuken in DNA herstelt de double-strand break repair (DSBR) pathway (soms het dubbele Holliday junction model genoemd) en de synthesis-dependent strand annealing (SDSA) pathway. In het geval van een dubbelstrengsbreuk wordt het 3′-uiteinde afgebroken en dringt het langere 5′-uiteinde het aangrenzende zusterchromatide binnen, waardoor een replicatiebel wordt gevormd. Wanneer deze bel het gebroken DNA nadert, dringt de langere 5′-antisense streng opnieuw de sense-streng van dit gedeelte van het DNA binnen, waarbij een tweede kopie wordt getranscribeerd. Wanneer de replicatie eindigt, worden beide strengen opnieuw met elkaar verbonden om twee Holliday Junctions te vormen, die vervolgens door eiwitten in verschillende patronen worden gesplitst. Een animatie van dit proces is hier te zien.

Dubbelstrengs DNA breuken in bacteriën worden gerepareerd door de RecBCD-route van homologe recombinatie. Breuken die zich slechts op één van de twee DNA-strengen voordoen, de zogenaamde enkelstrengsbreuken, worden geacht te worden gerepareerd door de RecF-route. Zowel de RecBCD- als de RecF-route omvatten een reeks reacties die bekend staan als takmigratie, waarbij enkelvoudige DNA-strengen worden uitgewisseld tussen twee gekruiste moleculen van duplex-DNA, en resolutie, waarbij die twee gekruiste moleculen van DNA uit elkaar worden geknipt en in hun normale dubbelstrengs toestand worden teruggebracht. Homologe recombinatie komt voor bij verschillende groepen virussen. Bij DNA-virussen, zoals het herpesvirus, verloopt de recombinatie via een “break-and-rejoin”-mechanisme, zoals bij bacteriën en eukaryoten. In bacteriën wordt de migratie van de vertakkingen vergemakkelijkt door het RuvABC-complex of het RecG-eiwit, moleculaire motoren die de energie van ATP-hydrolyse gebruiken om de verbinding te verplaatsen. De verbinding moet dan worden opgelost in twee afzonderlijke duplexen, waarbij ofwel de ouderlijke configuratie ofwel een gekruiste configuratie wordt hersteld. De oplossing kan tijdens homologe recombinatie horizontaal of verticaal plaatsvinden, waarbij patchproducten (indien in dezelfde oriëntatie tijdens het herstel van dubbelstrengbreuken) of splitsproducten (indien in verschillende oriëntaties tijdens het herstel van dubbelstrengbreuken) worden verkregen. RuvA en RuvB zijn takmigratie-eiwitten, terwijl RuvC een junctie-oplossend enzym is.

Er is bewijs voor recombinatie in sommige RNA-virussen, in het bijzonder positief-sense ssRNA-virussen zoals retrovirussen, picornavirussen, en coronavirussen. Er is controverse over de vraag of homologe recombinatie voorkomt in negatieve-sense ssRNA-virussen zoals influenza.

ResolutieEdit

In de budding gist Saccharomyces cerevisiae kunnen Holliday-juncties worden opgelost door vier verschillende paden die goed zijn voor vrijwel alle Holliday-junctie resolutie in vivo. Bij de route die de meeste crossovers in S. cerevisiae produceert, en mogelijk ook bij zoogdieren, zijn de eiwitten EXO1, MLH1-MLH3 heterodimer (MutL gamma genoemd) en SGS1 (ortholoog van Bloom-syndroom helicase) betrokken. Het MLH1-MLH3 heterodimeer bindt zich bij voorkeur aan Holliday juncties. Het is een endonuclease die enkelstrengsbreuken maakt in gesupercoiled dubbelstrengs-DNA. Het MLH1-MLH3 heterodimeer bevordert de vorming van cross-over recombinanten. Hoewel de andere drie paden, waarbij respectievelijk de eiwitten MUS81-MMS4, SLX1 en YEN1 betrokken zijn, in vivo het oplossen van Holliday juncties kunnen bevorderen, heeft afwezigheid van alle drie de nucleasen slechts een bescheiden invloed op de vorming van crossover producten.

Dubbelmutanten verwijderd voor zowel MLH3 (hoofdroute) als MMS4 (nevenroute) vertoonden dramatisch verminderde crossing over vergeleken met het wild-type (6- tot 17-voudig); de levensvatbaarheid van de sporen was echter redelijk hoog (62%) en chromosomale disjunctie bleek meestal functioneel.

Hoewel MUS81 een component is van een minder belangrijke cross-over pathway in de meiose van budding yeast, planten en gewervelde dieren, blijkt MUS81 in het protozoön Tetrahymena thermophila deel uit te maken van een essentiële, zo niet de overheersende cross-over pathway. De MUS81-route lijkt ook de voornaamste crossover-route te zijn in de splijtgist Schizosaccharomyces pombe.

De eiwitten MSH4 en MSH5 vormen een hetero-oligomere structuur (heterodimer) in gist en mens. In de gist Saccharomyces cerevisiae werken MSH4 en MSH5 specifiek om crossovers tussen homologe chromosomen tijdens meiose te vergemakkelijken. Het MSH4/MSH5-complex bindt en stabiliseert dubbele Holliday-joints en bevordert hun resolutie in crossover-producten. Een MSH4 hypomorfe (gedeeltelijk functionele) mutant van S. cerevisiae vertoonde een 30% genoomwijde vermindering in het aantal crossovers, en een groot aantal meiose met niet-uitwisselbare chromosomen. Toch gaf deze mutant levensvatbaarheidspatronen van sporen die erop wijzen dat segregatie van niet-uitwisselingschromosomen efficiënt plaatsvond. Dus in S. cerevisiae is goede segregatie blijkbaar niet geheel afhankelijk van crossovers tussen homologe paren.