Guanidine

Membraaneiwitten

Guanidine- en SDS-oplossingen zijn denaturerende oplosmiddelen, maar wij wilden natuurlijk ook de natieve toestand van membraaneiwitten karakteriseren. De moeilijkheid hier was dat er nog geen consensus was over hoe de natieve toestand te definiëren of op te vatten – wat, voor nieuwkomers zoals wij, zich vertaalde in onzekerheid, omdat we niet het soort ervaring hadden dat ons in staat zou stellen een scherpzinnige gok te doen over welke van de strijdende ideeën waarschijnlijk juist zou blijken te zijn.

Zelfs de fosfolipide bilaag, het enige onmisbare concept voor het meest minimale begrip van celmembranen, werd nog steeds betwist, ondanks het feit dat het bijna 50 jaar eerder voor het eerst was aangetoond in rode bloedcellen en dat het eigenlijk de enig denkbare ordening was op basis van de thermodynamica, een direct gevolg van Irving Langmuir’s klassieke metingen uit 1917 met monolagen van amfifiele stoffen. Ik heb de belachelijk trage aanvaarding van het tweelagenconcept in de tussenliggende periode beschreven in mijn boek, Ben Franklin Stilled the Waves . Het punt hier is dat er nog steeds scepsis heerste toen wij betrokken raakten bij het membraanonderzoek.

En onder degenen die overtuigd waren van de lipide bilaag, was de wijze van incorporatie van eiwitten in membranen nog steeds open voor discussie. Sommigen, zoals onze Duke collega David Robertson, waren terughoudend om te geloven dat eiwitten werkelijk een bilaag konden doordringen of doorkruisen. Twee zeer verschillende conceptuele beelden, genomen tijdens een conferentie van de New York Academy of Sciences in 1972, worden getoond in figuur 3 . Het ene is Robertson’s “eenheidsmembraan” met eiwitten helemaal aan de buitenkant. Het andere is Vanderkooi’s beeld van cytochrome oxidase complexen in mitochondriale membranen: het eiwit is realistischer gepositioneerd, maar er is nog geen conceptie van verschillende hydrofiele en hydrofobe domeinen en hoe deze de eiwit-lipide interactie zouden kunnen dicteren. Later in datzelfde jaar 1972 werd het nu conventionele geïdealiseerde beeld van fosfolipide bilayers, met functionerende eiwitten die er helemaal doorheen lopen, uiteindelijk gepopulariseerd door Singer en Nicolson’s “fluid mosaic” model .

Fig. 3. Twee verschillende conceptuele beelden van membraaneiwitten, beide voorgesteld op dezelfde bijeenkomst in New York in 1972 : (a) Robertson dacht dat eiwitten asymmetrisch geplaatst zouden zijn, buiten de twee tweeilaagoppervlakken; (b) Vanderkooi’s beeld van cytochrome oxidase complexen in dwarsdoorsnede.

In het laboratorium waren dit opwindende tijden, de opwindendste die ik me kan herinneren. We leerden hoe we goedaardige detergenten konden gebruiken, die, in tegenstelling tot SDS, membraaneiwitten konden oplossen zonder ernstige denaturatie, in een omgeving die de inheemse toestand simuleerde, maar een omgeving waarin ze ook gemakkelijk toegankelijk zouden zijn voor moleculaire karakterisering – een vooruitgang waarin we gedeeltelijk waren vooruitgelopen door twee sympathieke jonge mannen uit Finland, Kai Simons en Ari Helenius .

In de praktijk beperkten we ons nog steeds meestal tot het meten van het molecuulgewicht en de vraag hoeveel polypeptideketens er per molecuul waren, maar de eiwitten waarop deze vragen betrekking hadden, waren door een behandeling met detergentia gescheiden van andere membraancomponenten. Het belangrijkste is dat veel van de eiwitten een bekende cellulaire functie hadden en dat onze metingen relevant waren voor deze functies. Ik heb de rode bloedcellen al genoemd, maar we slaagden er in feite in een reeks biologisch relevante onderwerpen te bestrijken, in veel gevallen aangespoord door de missionaire ijver van studenten. Zo kwam een afgestudeerde student fysiologie, Stuart Grefrath, met belangstelling voor neurofysiologie, naar ons laboratorium om de polypeptideketens van een exciteerbaar membraan op te sommen – in dit geval van de reukzenuw van een garnaal – en dit leidde tot onze latere betrokkenheid bij verschillende andere actieve transportsystemen. (Stuart zelf overleed helaas als gevolg van een aangeboren hart- en vaatziekte voordat hij zijn vroege belofte met een onafhankelijke carrière kon waarmaken). Cerebrale myeline was een ander membraan van het zenuwstelsel dat we onderzochten.

Ook de moeite waard om eruit te lichten zijn twee bezoekers aan het laboratorium die ervoor kozen om samen te werken: Neal Robinson, een postdoctoraal medewerker, en Leon Visser, die met sabbatsverlof was van het CSIR in Pretoria, Zuid-Afrika). Zij hebben zeer goed werk verricht door de domeinstructuur van cytochroom b5 kwantitatief vast te stellen, een soort prototype om te illustreren hoe membraaneiwitten aan membranen vastzitten en toch hun functie in het aangrenzende cytoplasma uitvoeren.

In andere projecten reageerden wij op verzoeken van verre collega’s. Ik heb reeds het werk met Arthur Karlin aan de acetylcholine receptor van een elektrische vis genoemd. Een ander voorbeeld was bacteriorhodopsine, waarvoor wij in opdracht van Walter Stoeckenius van de Universiteit van Californië metingen verrichtten in een detergentoplossing. Er was hier een belangrijke vraag, die verband hield met het mechanisme van de protonpompactiviteit van dit eiwit: is het natieve eiwit functioneel een monomeer of (zoals sommige gegevens leken te suggereren) is het een trimer? Ons opgelost eiwit was ontegenzeggelijk een monomeer en spectraal bewijs wees uit dat het dezelfde cyclus van moleculaire veranderingen doormaakte als in het inheemse membraan.

In de meeste gevallen raakten we zelf niet direct betrokken bij pogingen om uit te puzzelen hoe receptoren of pompen of kanalen werkten, maar we werden ons onvermijdelijk bewust van wat de problemen waren. Het was een werkelijk verrijkende ervaring, heel anders dan in de tijd dat serumalbumine en β-lactoglobuline (verkregen van commerciële leveranciers) de voornaamste doelen van ons onderzoek waren.

In het geval van ionenpompen gingen we wel de fysiologie in, meestal op het niveau van hypothese of theorie; we leerden hoe we kinetische schema’s met een computer konden modelleren; we bezochten de nodige conferenties; enz. Ons laatste sabbatical leave – naar het Max Planck Instituut in Heidelberg – was in dit opzicht belangrijk. De voorzitter van de afdeling fysiologie van Duke, Ted Johnson, sloot zich bij deze gelegenheid bij ons aan, zodat wij met z’n drieën actief samenwerkten. Ted was al lange tijd een computerenthousiast en had ieder lid van de faculteit fysiologie aangesloten op de centrale computerfaciliteit van de North Carolina Research Triangle voordat het in de mode kwam om departementale fondsen op die manier te besteden. In die tijd moesten we onze eigen programma’s schrijven voor de computer, wat moeilijk was voor mij, maar ik geloof dat we een aantal nuttige resultaten hebben verkregen, vooral over kinetische modellen voor de pompcyclus van de ATP-aangedreven Na,K-pomp. We werkten op onorthodoxe uren, ook in het weekend en op feestdagen, wat onze gastheren in Heidelberg, die gewend waren de centrale verwarming uit te zetten wanneer het laboratorium niet bezet zou zijn, soms niet beviel. Ongeveer om de tien dagen reden we de grens over naar Straatsburg voor een gastronomische lunch – vergezeld van Elzasser wijnen, waarvan we de smaak sindsdien hebben weten te waarderen.