Genomic differentiation and intercontinental population structure of mosquito vectors Culex pipiens pipiens en Culex pipiens molestus

Onafhankelijke monofyletische oorsprong van Culex pipiens pipiens en Culex pipiens molestus

Twee alternatieve hypotheses zijn voorgesteld om de verschillen in ecologische en fysiologische strategieën van Cx. p. pipiens en Cx. p. molestus19. Eén hypothese verklaart deze differentiatie als een snelle verschuiving in fysiologische en gedragskenmerken als aanpassing aan een ondergrondse omgeving die geassocieerd wordt met menselijke activiteiten22. In dit scenario moeten de lokale populaties van Cx. p. molestus nauw verwant zijn met de lokale populaties van Cx. p. pipiens30. In dit scenario wordt Cx. p. molestus beschouwd als een eco-fysiologische variant van Cx. p. pipiens. Een alternatieve hypothese suggereert dat het verschil tussen Cx. p. pipiens en Cx. p. molestus een gevolg is van het verschil in hun evolutionaire geschiedenis. Ecologische en fysiologische strategieën van Cx. p. molestus zouden eerst kunnen zijn ontstaan onder het warme klimaat19. Later bleek een dergelijke strategie relevant vanwege de menselijke activiteiten die een ondergrondse omgeving creëerden en zo Cx. p. molestus over de hele wereld verspreidden. Dit scenario beschouwt Cx. p. molestus en Cx. p. pipiens als afzonderlijke evolutionaire entiteiten.

In onze studie hebben we deze hypothesen getest met behulp van een volledige genoomanalyse van 40 Cx. p. molestus en Cx. p. pipiens monsters verzameld op vier locaties in Eurazië en Noord-Amerika. Onze bevindingen verwierpen de hypothese van het opnieuw ontstaan van Cx. p. molestus uit de lokale populaties van Cx. p. pipiens en ondersteunden sterk het idee van een onafhankelijke monofyletische oorsprong van zowel Cx. p. pipiens als Cx. p. molestus uit verschillende continenten. NJ en ML analyses clusteren afzonderlijk Cx. p. pipiens en Cx. p. molestus uit de Republiek Belarus, de Kirgizische Republiek, en Chicago, IL, USA (Fig. 2, Supplementary Figs. 1-3). De aanwezigheid van een bijkomende hybride cluster gevormd door autogene en anautogene veld verzamelde specimens uit Washington, D.C., USA weerspiegelt meer waarschijnlijk het bestaan van een Cx. pipiens – Cx. quinquefasciatus hybride zone in dit gebied16. Op basis van genetische afstanden is deze cluster echter veel nauwer verwant aan de Euraziatische Cx. p. pipiens dan aan de Cx. p. molestus uit Eurazië en de VS (Chicago, IL). Bovendien identificeerden PCA- (Fig. 3) en ADMIXTURE- (Fig. 4) analyses twee verschillende genetische clusters die overeenkomen met Cx. p. pipiens en Cx. p. molestus. In beide gevallen groepeerden alle specimens uit Washington, D.C. zich samen met Cx. p. pipiens van andere locaties. De genoomwijde paarsgewijze Fst-waarden waren zeer significant voor alle vergelijkingen (Fig. 5). We identificeerden geen specifieke regio van hoge divergentie in het genoom (Fig. 6). Over het algemeen waren de Fst-waarden veel hoger tussen Cx. p. molestus en Cx. p. pipiens dan tussen autogene en anautogene stalen van Cx. p. pipiens uit Washington, D.C. De meest divergerende groep, gebaseerd op alle uitgevoerde analyses, was de stam van Cx. p. molestus uit Chicago, IL, wat verklaard kan worden door de zeer lage genetische diversiteit van deze stam, veroorzaakt door de langdurige kolonisatie en mogelijke bottleneck, die genetische drift versnelde (Fig. 7).

Gelijkaardige waarnemingen over de onafhankelijke monofyletische oorsprong van Cx. p. molestus en Cx. p. pipiens werden verkregen met behulp van microsatellietanalyse in ~600 monsters van Cx. pipiens muggen afkomstig van verschillende wereldwijde locaties19. De unrooted distance tree procedure clusterde bovengrondse populaties van Cx. p. pipiens en ondergrondse populaties van Cx. p. molestus uit Noord- en Zuid-Europa afzonderlijk. Vergelijkbaar met onze studie vormden de bovengrondse populaties van Cx. p. pipiens uit de VS een bijkomende cluster, wat wijst op een meer intense hybridisatie tussen de leden van het Cx. pipiens complex in Noord-Amerika. De vermengingsanalyse gaf de aanwezigheid aan van drie grote clusters die overeenkwamen met Cx. p. molestus, Cx. p. pipiens, en Cx. quinquefasciatus. De laatste cluster werd in deze studie alleen in de VS-monsters aangetroffen. Een ander werk op basis van geamplificeerde fragmentlengtepolymorfisme (AFLP)-analyses vergeleek monsters uit Zuid- en Noord-Europa en stammen uit Chicago, IL, USA24. De in deze studie gebruikte Noord-Amerikaanse en Europese populaties vertoonden een vergelijkbaar ADMIXTURE patroon in de AFLP genoom scan. De analyse van COI-genen wees ook op een monofyletische oorsprong van Cx. p. pipiens en Cx. p. molestus in Europa, Azië en Afrika26.

Dus de onafhankelijke monofyletische oorsprong en het hoge niveau van genetische divergentie tussen Cx. p. molestus en Cx. p. pipiens suggereren dat deze twee leden van het Cx. pipiens complex afzonderlijke fylogenetische entiteiten vertegenwoordigen met onafhankelijke evolutionaire geschiedenissen voorafgaand aan door de mens gemedieerde translocatie.

Concepten van soortvorming en evolutie van het Culex pipiens complex

Theoretische modellen van soortvorming bij dieren kunnen worden onderverdeeld in twee grote groepen: allopatrische of geografische soortvorming en sympatrische of ecologische soortvorming. Het eerste concept van soortvorming, dat intensief werd gepromoot door E. Mayr3, suggereert dat beginnende taxa eerst geografisch geïsoleerd raken. Deze situatie vermindert de genenstroom tussen de populaties en kan leiden tot accumulatie van mutaties die genetische onverenigbaarheid tussen de hybriden veroorzaken. Een alternatief concept van soortvorming legt de nadruk op ecologische barrières tussen de opkomende taxa als belangrijke drijfveren voor evolutie31. Dit scenario gaat uit van de ontwikkeling van reproductieve isolatie tussen de populaties als gevolg van aanpassing aan verschillende milieus zonder geografische isolatie, die gewoonlijk plaatsvindt in het zicht van genenstroom. In deze situatie worden de hybriden tussen beginnende taxa minder geschikt voor het milieu, hetgeen natuurlijke selectie bevordert van alle eigenschappen die de paring tussen hen verminderen. Wij denken dat de algemene diversificatie van de ondersoorten Cx. p. pipiens en Cx. p. molestus een treffend voorbeeld is van soortvorming door mechanismen van isolatie-door-ecologie. In onze studie bepaalde de Fst analyse significante niveaus van genomische divergentie tussen Cx. p. pipiens en Cx. p. molestus (Figs. 5 en 6) over het volledige genoom zonder duidelijke eilanden van soortvorming. Verrassend genoeg waren de niveaus van differentiatie lager rond de centromeren, waarschijnlijk als gevolg van het lage aantal betrouwbare SNVs in deze sterk repetitieve regio’s. De differentiatie was extreem hoog tussen de Chicago, IL, USA stammen van Cx. p. pipiens en Cx. p. molestus, maar was lager tussen de ondersoorten in de Euraziatische muggencollecties. Over het algemeen suggereren deze observaties een significante beperking van de genenstroom tussen de ondersoorten.

Er zijn verschillende mechanismen van voortplantingsisolatie tussen Cx. p. pipiens en Cx. p. molestus beschreven17. Twee daarvan zijn prezygotisch, vóór de bevruchting, en verminderen de paringsmogelijkheden van de muggen. Het eerste mechanisme houdt verband met de habitatspecialisatie van de larven: Cx. p. molestus houdt zich op in kelders of andere ondergrondse milieus, maar Cx. p. pipiens verkiest open bovengrondse watermassa’s als broedplaatsen. Dit verkleint de kans dat de twee ondersoorten elkaar in het volwassen stadium ontmoeten en paren. Het tweede isolatiemechanisme berust op de verschillen in paringsgedrag tussen Cx. p. molestus en Cx. p. pipiens. De mannetjes van Cx. p. molestus vormen gewoonlijk homogene zwermen dicht bij de grond en hebben slechts een beperkte ruimte nodig om te paren17. De mannetjes van Cx. p. pipiens daarentegen zwermen dicht bij het gebladerte, ongeveer 2-3 m boven de grond. Experimentele studies van het paringsgedrag in kleine kooien toonden aan dat bij kruisingen van wijfjes en mannetjes van Cx. p. molestus het copulatiesucces 90% bedroeg, maar bij Cx. p. pipiens slechts 3,3%32. Bij kruisingen tussen ondersoorten tussen Cx. p. molestus en Cx. p. pipiens was het copulatiesucces eveneens laag en varieerde van 6,6% tot 10%, afhankelijk van het geslacht van de ondersoort. Deze studie toonde aan dat wijfjes van beide ondersoorten actief copulatie vermijden met mannetjes van een andere ondersoort. Bovendien slaagden Cx. p. pipiens vrouwtjes er niet in sperma van Cx. p. molestus te ontvangen en produceerden ze bijgevolg geen eitjes.

Twee andere voortplantingsisolerende mechanismen beschreven voor Cx. p. pipiens en Cx. p. molestus zijn postzygotisch, ze treden op na de paring en resulteren in een verminderde fitness van de hybriden. Een van de mechanismen houdt verband met de overerving van diapauze bij hybriden van Cx. p. molestus en Cx. p. pipiens als een recessieve eigenschap8. F1-hybriden en een aanzienlijk deel van de F2-hybriden zijn niet in staat diapauze te ontwikkelen en kunnen niet overleven onder winterse omstandigheden. Dit mechanisme zou misschien de hogere introgressieniveaus bij Cx. p. pipiens op zuidelijke locaties kunnen verklaren19,23,24. Tenslotte worden de leden van het Cx. pipiens complex blootgesteld aan cytoplasmatische incompatibiliteit van hybriden die besmet zijn met verschillende stammen van de rickettsiale parasiet Wolbachia pipientis. Ondanks cytoplasmatische introgressie van deze parasiet door hybridisatie tussen de leden van het Cx. pipiens complex33, kan cytoplasmatische incompatibiliteit de overlevingskansen van de hybriden aanzienlijk beperken. Bijvoorbeeld, W. pipientis infectie verminderde significant de hybridisatie tussen Cx. pipiens en Cx. quinquefasciatus in Zuid-Afrika34. Een andere studie toonde aan dat in Euraziatische populaties Cx. p. molestus slechts door één stam van W. pipientis werd geïnfecteerd, maar Cx. p. pipiens door twee verschillende stammen35. Bovendien werden de specimens van Cx. p. molestus en Cx. p. pipiens, die wij in onze studie gebruikten, in het zuiden van de Kirgizische Republiek met dezelfde stammen van W. pipientis geïnfecteerd, maar in het noorden van de Republiek Belarus met verschillende stammen. Dit kan dus een verklaring zijn voor de verschillen in introgressie van Cx. p. molestus naar Cx. p. pipiens die in de Republiek Belarus meer uitgesproken was dan in de Republiek Kirgizstan. Een interessant voorbeeld van besmettelijke soortvorming werd beschreven in het Zuid-Amerikaanse Drosophila paulistorum-complex. In dit complex werden zes halfsoorten met overlappende geografische verspreiding reproductief geïsoleerd als gevolg van premating en postmating isolatie veroorzaakt door de Wolbachiae infectie36.

Recente genomische studies uitgevoerd op verschillende organismen, waaronder Drosophila simulans37, Rhagoletis fruitvliegen38,39, en Heliconius vlinders40,41 leveren extra bewijs dat ecologische soortvorming in de natuur voorkomt. De genomische patronen van speciatie kunnen zeer verschillend zijn2 , variërend van kleine genomische eilandjes van speciatie40 tot aanzienlijke niveaus van divergentie over het gehele genoom. Wijdverspreide genomische divergentie werd geïdentificeerd tussen de beginnende soorten Anopheles gambiae en An. coluzzii in het An. gambiae complex42. Deze soorten werden oorspronkelijk geïdentificeerd door verschillen in de structuur van hun ribosomaal DNA als S- en M-vormen43, maar later werd hun taxonomische status verheven tot het soortniveau44. An. gambiae en An. coluzzii worden verondersteld voortplantingsbarrières te ontwikkelen in sympatry als gevolg van de verschillen in hun ecologische voorkeuren45. Het larvenstadium van An. gambiae wordt geassocieerd met kleine regenplassen. An. coluzzi daarentegen exploiteert hardnekkige waterreservoirs die geassocieerd worden met rijstteelt. Hoewel de prezygotische barrières tussen de soorten onvolledig zijn46 , ontwikkelden zij verschillen in hun zwermgedrag47,48 en divergerende zangtypes49.

Dus, een hoog niveau van genoom-brede divergentie, een opvallend verschil in aanpassing aan verschillende ecologische omgevingen en bewijs van prezygotische en postzygotische barrières voor paring suggereren dat Cx. p. pipiens en Cx. p. molestus afzonderlijke ecologische eenheden vertegenwoordigen die een beginnende ecologische speciatie ondergaan.

Hybridisatie in het Culex pipiens complex

De meest intrigerende observatie van de leden van het Cx. pipiens complex is dat, ondanks verschillen in ecologie, fysiologie, gedrag, en geografische verspreiding, zij nog steeds kunnen hybridiseren en levensvatbare nakomelingen in de natuur kunnen produceren, wat erop wijst dat de reproductieve isolatie tussen hen niet volledig is. Onze studie toonde ook significante hybridisaties aan tussen de ondersoorten Cx. p. molestus en Cx. p. pipiens. Vergelijking van het volledige genoom toonde aan dat de meeste Cx. p. pipiens stalen individuen vertegenwoordigen met een zekere mate van introgressie van Cx. p. molestus (Fig. 4). We stelden een grote discrepantie vast tussen de nucleaire en mitochondriale fylogenieën (Fig. 2, 8), wat erop wijst dat, historisch gezien, de overdracht van mitochondriale genomen tussen de ondersoorten kan gebeuren. Tegelijkertijd hebben wij geen gedeelde haplogroepen waargenomen tussen de lokale populaties van de ondersoorten. In de continenten waren alle mitochondriale fylogenieën sterk monofyletisch, wat wijst op dispersie en hybridisatie door mannen. De vermenging met Cx. p. molestus was hoger in de zuidelijke populaties van Cx. p. pipiens in de Kirgizische Republiek en in Washington, D.C., USA, maar lager in de noordelijke populaties in de Republiek Wit-Rusland en Chicago, IL, USA. Dit zou te maken kunnen hebben met het onvermogen van de hybriden om diapauze te ontwikkelen in koude klimaten. Ter vergelijking: microsatellietanalyse bracht een bescheiden hybridisatieniveau tussen Cx. p. pipiens en Cx. p. molestus aan het licht van ~8% in de noordelijke steden van de USA (Chicago, IL en New York, NY)30,50. In Zuid-Europa, waar Cx. p. pipiens en Cx. p. molestus beide bovengronds kunnen worden aangetroffen, waren de onderlinge hybridisatieniveaus vergelijkbaar en werden ze geschat op 8-10%51. Veel hogere hybridisatieniveaus werden gevonden in zuidelijke populaties in het oosten van de USA, waar ~40% van alle stalen geïdentificeerd werden als hybriden tussen Cx. p. molestus en Cx. p. pipiens19. De algemene hybridisatiegraad tussen de leden van Cx. pipiens was dus hoger in Noord-Amerika dan in de Oude Wereld. Ter vergelijking: de hybridisatie tussen cryptische soorten in het An. gambiae complex (An. gambiae en An. coluzzi) varieerde significant van 1% in Mali46 tot >20% in Guinee Bissau52, wat vergelijkbaar is met de algemene hybridisatieniveaus tussen Cx. p. molestus en Cx. p. pipiens.

Intrigerend is dat we in onze studie in geen enkel monster van Cx. p. molestus uit de Republiek Belarus, de Kirgizische Republiek en Chicago, IL, USA een Cx. p. pipiens vermengingsteken hebben vastgesteld (Fig. 4). Deze bevindingen wijzen op een zeer beperkte of geen genenstroom van Cx. p. pipiens naar Cx. p. molestus. Gelijkaardige bevindingen van asymmetrische introgressie van Cx. p. molestus naar Cx. p. pipiens werden aangetoond door eerdere studies20,51. Het mechanisme van asymmetrische introgressie is momenteel onbekend. Eén hypothese suggereert dat mannetjes van Cx. p. molestus, die in beperkte ruimten kunnen paren, kunnen hybridiseren met zowel Cx. p. molestus als Cx. p. pipiens vrouwtjes. Daarentegen zouden Cx. p. pipiens mannetjes, die ruimte nodig hebben om te zwermen, meer geneigd zijn om te paren met Cx. p. pipiens vrouwtjes51. Er zijn echter meer populatiegenetische en experimentele studies nodig om dit fenomeen te verklaren.

Ten slotte toonde onze studie aan dat Cx. p. pipiens autogenese kan ontwikkelen als gevolg van adaptieve introgressie van het genetisch materiaal van Cx. p. molestus. In het veld verzamelden we monsters van bovengrondse en ondergrondse omgevingen in Washington, D.C., USA, en selecteerden we muggen voor autogenie. De ondergrondse muggen waren autogeen maar de bovengrondse muggen waren anautogeen. Echter, muggen uit zowel autogene als anautogene kolonies vormden een enkele cluster wanneer neighbor joining analyse werd toegepast (Fig. 2). Bovendien clusteren PCA (Fig. 3) en ADMIXTURE (Fig. 4) deze monsters samen met Cx. p. pipiens van andere locaties. Populaties met gemengde kenmerken werden aangetroffen in Europa51 en in de VS53. In Portugal werd ook een ongewoon patroon van bloedvoedergedrag bij vogels gevonden bij Cx. p. molestus54.

Dus de aanwezigheid van voortdurende hybridisatie tussen leden van het Cx. pipiens complex suggereert dat het speciatieproces tussen hen niet voltooid is en dat postzygotische barrières van reproductieve isolatie niet volledig gevormd zijn. In het algemeen zijn wij van mening dat de leden van het Cx. pipiens complex een opmerkelijk model vormen voor het bestuderen van verschillende aspecten van geografische en ecologische speciatie in het licht van de voortdurende genenstroom tussen hen en lokale aanpassingen aan diverse omgevingen.