Gelfiltratiechromatografie

Gelfiltratiechromatografietoepassingen

Gelfiltratiechromatografie, een vorm van chromatografie met uitsluiting van grootte, kan worden gebruikt om moleculen en complexen in een monster te fractioneren in fracties met een bepaalde grootte, om alle moleculen groter dan een bepaalde grootte uit het monster te verwijderen, of een combinatie van beide bewerkingen. Gelfiltratiechromatografie kan worden gebruikt om verbindingen zoals kleine moleculen, eiwitten, eiwitcomplexen, polysacchariden en nucleïnezuren in waterige oplossing te scheiden. Wanneer een organisch oplosmiddel wordt gebruikt als de mobiele fase, wordt het proces in plaats daarvan gelpermeatiechromatografie genoemd.

Gel filtratie chromatografie kan ook worden gebruikt voor:

• Fractionering van moleculen en complexen binnen een vooraf bepaald groottebereik
• Grootteanalyse en -bepaling
• Verwijdering van grote eiwitten en complexen
• Bufferuitwisseling
• Ontzouten
• Verwijdering van kleine moleculen zoals nucleotiden, primers, kleurstoffen en verontreinigingen
• Beoordeling van monsterzuiverheid
• Scheiding van gebonden van ongebonden radio-isotopen

Gel filtratie chromatografie media voor alle bovenstaande toepassingen zijn beschikbaar in voorverpakte gravity flow kolommen, spin kolommen, lage druk en middendruk chromatografie kolommen, en gebottelde harsen.

Gelfiltratiechromatografiemechanisme

In een gelfiltratiechromatografiekolom bestaat de stationaire fase uit een poreuze matrix, en de mobiele fase is de buffer die tussen de matrixkorrels vloeit. De korrels hebben een bepaalde poriegrootte, het zogenaamde fractioneringsbereik. Moleculen en complexen die te groot zijn om de poriën binnen te dringen, blijven in de mobiele fase en bewegen door de kolom met de stroom van de buffer. Kleinere moleculen en complexen die wel in de poriën kunnen komen, komen in de stationaire fase terecht en worden door de gelfiltratiekolom geleid via een langere weg door de poriën van de korrels.

Elk molecuul of complex dat zich boven het fractioneringsbereik voor een bepaalde gelfiltratiechromatografiekolom bevindt, zal sneller door de kolom bewegen dan elk molecuul dat in de stationaire fase kan komen. Daarom zal elk bestanddeel in het monster dat zich boven het fractioneringsgebied bevindt, eerst elueren (in het lege volume) en pas daarna alles wat zich binnen het fractioneringsgebied bevindt. De minimumgrootte die in de mobiele fase blijft en niet in de stationaire fase terechtkomt, staat bekend als de uitsluitingsgrens. Bio-Rad biedt gelfiltratiechromatografiemedia en -kolommen aan met uitsluitingsgrenzen die variëren over drie orden van grootte, van 100 daltons tot 100.000 daltons (100 kDa).

Moleculen en complexen die de stationaire fase kunnen binnengaan, zullen worden gefractioneerd naar gelang hun grootte. Kleinere moleculen zullen diep in de poriën migreren en meer worden vertraagd dan grotere moleculen, die niet zo gemakkelijk in de poriën doordringen en dus sneller uit de kolom worden geëlueerd. Dit verschil in poriemigratie leidt tot fractionering van de componenten naar grootte, waarbij de grootste het eerst elueren.

In gelfiltratiechromatografiekolommen die zijn ontworpen voor ontzouting, bufferwisseling en de verwijdering van kleine moleculen zoals nucleotiden, komen de zouten en kleine verbindingen gemakkelijk in de poriën, worden vertraagd en migreren langzamer door de kolom dan de grotere eiwitten of nucleïnezuren. De interessante bestanddelen van het monster worden dus eerder geëlueerd dan zouten, nucleotiden, enz. DNA-opruimkits die dit mechanisme gebruiken, bevatten vaak gelfiltratie-spinkolommen.

Resolutie, hier gedefinieerd als de scherpte van de grenzen tussen de groottefracties, wordt bepaald door de korrelgrootte en een aantal andere factoren. Een kleinere korrelgrootte levert in het algemeen een hogere resolutie op in een gelfiltratiechromatografiekolom. Compacte moleculen diffunderen sneller door de stationaire fase dan lineaire moleculen. Grootte-exclusie, fractioneringsbereik en elutiesnelheid worden beïnvloed door buffersamenstelling, ionensterkte en pH. Voor de fractionering van complexe mengsels van eiwitten moeten de elutietijden en de grenzen van de grootte-uitsluiting wellicht empirisch worden bepaald.

Gelfiltratiechromatografiemedia

Een belangrijk criterium voor gelfiltratiechromatografiemedia is dat de media inert zijn en dat niets in het monster of een buffer zich aan de media bindt. Een andere overweging is het type gelfiltratiekolom dat wordt gebruikt en of deze wordt gebruikt in een chromatografiesysteem onder druk of in zwaartekrachtstroom- of spinkolommen. Indien een chromatografiesysteem onder druk wordt gebruikt, moeten zowel de kolom als de media de gebruikte druk en stroomsnelheden kunnen verdragen.

Gewoonlijk gebruikte media voor gelfiltratiechromatografie zijn gebaseerd op agarose- of polyacrylamidekorrels, dextrose voor zwaartekracht- of lagedruksystemen, en polymere harsen voor middendruksystemen. De keuze van het medium hangt af van de eigenschappen van de te scheiden bestanddelen en van andere experimentele factoren. Hieronder volgen algemene overwegingen bij het bepalen van de keuze van gelfiltratiechromatografiemedia:

• Fractioneringsbereik
• Size exclusion limit
• Bedrijfsdruk
• Flow rate
• Viscositeit van het monster
• pH-bereik
• Autoclaveerbaarheid
• Tolerantie voor met water mengbaar organisch oplosmiddel; sommige monsters kunnen beter oplosbaar zijn in een met water vermengbaar organisch mengsel
• Tolerantie voor detergenten, chaotrope stoffen, formamide, enz.
• Bedrijfstemperatuur

De soorten monsters, de keuze van media, en de opstelling van het chromatografiesysteem zullen bepalen welke parameters het belangrijkst zijn voor een bepaalde zuiveringstoepassing.