Gamma-Glutamyl Transpeptidase

Activiteit en Specificiteit

Daarom wordt de door dit enzym gekatalyseerde reactie in het algemeen opgevat als de overdracht van een γ-glutamylgroep aan een verscheidenheid van acceptormoleculen, zoals water, aminozuren, dipeptiden en γ-glutamyl-donor zelf, afhankelijk van de reactieomstandigheden. Deze katalytische eigenschappen zijn geassocieerd met het katalytische mechanisme van GGT, waarbij de reactie verloopt via een acylatie-deacylatie dubbel verplaatsingsmechanisme via een γ-glutamyl-enzymatussenproduct.

Zoals verwacht op grond van de structuren van het natuurlijke substraat glutathion en zijn derivaten, herkent GGT strikt het γ-glutamyl gedeelte, maar heeft een tamelijk brede substraatspecificiteit met betrekking tot de vertrekkende groep (Xaa). Glutathion, zijn S-conjugaten, glutathion-disulfide, γ-glutamyl di- of tripeptiden, glutamine, l-α-methyl derivaten van γ-glutamyl amiden, leukotriëen C4, poly-γ-glutamyl derivaten worden alle aanvaard als substraat. Kunstmatige substraten zoals l-γ-glutamyl-p-nitroanilide (l-γ-Glu-pNA) en fluorescerende l-γ-glutamyl-7-amino-4-methylcumarine (l-γ-Glu-AMC) zijn actieve substraten die gewoonlijk worden gebruikt in aanwezigheid of afwezigheid van γ-glutamyl acceptoren (zie hieronder) voor respectievelijk transpeptidase of hydrolase assay.

De substraatspecificiteit met betrekking tot de acceptor is het meest uitgebreid bestudeerd met GGT uit rattennieren. De l-isomeren van neutrale aminozuren zoals l-cystine, l-Gln, l-Met, l-Ala, l-Cys en l-Ser zijn goede acceptoren, maar hydrofobe en vertakte ketenaminozuren zoals l-Phe, l-Trp, l-Leu, l-Ile en l-Val zijn tamelijk slechte substraten. d-Aminozuren en α-gesubstitueerde aminozuren fungeren niet als acceptorsubstraten. Daarom is het gebruik van d-γ-Glu-pNA een geschikte manier om autotranspeptidatie te onderdrukken bij het meten van de hydrolaseactiviteit. Aangezien de bindingsplaats van de acceptor overlapt met de subsites voor het Cys-Gly-gedeelte van glutathion, geeft het enzym de voorkeur aan dipeptiden met Gly aan de C-terminal, zoals l-Met-Gly, l-Gln-Gly, l-Ala-Gly, l-cystinyl-bis-Gly, Gly-Gly en l-Ser-Gly als acceptorsubstraten in afnemende volgorde van relatieve activiteit . De peptiden met meer dan twee aminozuurresiduen zijn zeer slechte acceptoren. De Km-waarden voor de accepterende aminozuren en dipeptiden zijn betrekkelijk hoog en liggen tussen 0,1 en 5 mM, maar Gly-Gly (Km=3 mM) wordt het meest gebruikt als accepterend substraat voor transpeptidase-activiteit. Hoge concentraties van acceptormoleculen remmen GGT competitief ten opzichte van de γ-glutamyl donor (γ-Glu-Xaa), waarschijnlijk als gevolg van de overlap van de bindingsplaats voor Xaa en die voor de acceptor. De substraatspecificiteit ten opzichte van de Cys-sub-site hangt af van de oorsprong van het enzym; het E. coli-enzym, bijvoorbeeld, prefereert basische aminozuren (l-Arg, l-Lys en l-His) en aromatische aminozuren (l-Phe, l-Trp en l-DOPA) op deze site . Met de acceptorspecificiteit moet echter voorzichtig worden omgesprongen, omdat de schijnbare activiteit ook afhankelijk is van de effectieve concentratie van het gedeprotoneerde aminozuur dat bij de betrokken pH beschikbaar is. De relatief hoge activiteit die met Gly-Gly wordt waargenomen, is gedeeltelijk toe te schrijven aan de lage pKa van dit dipeptide . Gedeprotoneerde aminogroepen van acceptorsubstraten lijken noodzakelijk te zijn voor transpeptidatie.

Het meest gebruikte donorsubstraat voor enzymatische analyse is l-γ-Glu-pNA. Een typisch testmengsel voor de transpeptidase-activiteit van het rattennierenzym bestaat uit 5 mM l-γ-Glu-pNA, 100 mM Gly-Gly in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) bij 25°C. De toevoeging van een voldoende concentratie Gly-Gly onderdrukt effectief de hydrolyse en autotranspeptidatie. De optimale pH van GGT is ongeveer 7,5-9 voor transpeptidatie, maar de pH-afhankelijkheid is veel kleiner voor hydrolyse. Dit is consistent met het feit dat de schijnbare transpeptidase activiteit gedeeltelijk afhankelijk is van de effectieve concentratie van de vrije aminogroep van acceptoren.

De hydrolase activiteit voor glutamine wordt tot 12-voudig verhoogd door toevoeging van acceptor site-directed modulators zoals maleaat, hippuraat en glycocholaat. De toevoeging van deze verbindingen remt de binding van acceptorsubstraten en de γ-glutamyl donors die de Cys-Gly subsites bezetten. De toevoeging van γ-glutamyl donors of de binding van remmers op de γ-glutamyl donor site verhoogt de affiniteit van deze modulatoren, wat wijst op coöperatieve interacties tussen de bindingsplaatsen voor γ-glutamyl donors en acceptors (voor een overzicht zie Tate & Meister ). Er wordt gesuggereerd dat de door deze modulatoren bezette acceptorplaats een conformatieverandering van GGT in een actieve vorm bevordert, waardoor de vorming van een overgangstoestand wordt vergemakkelijkt. Dit wordt ook voorgesteld om de toename van de inactiveringssnelheid van zoogdierenzymen door acivicine te verklaren (vide infra), maar dit werd niet waargenomen bij remming door een γ-monofluorofosfonaat, een affiniteitslabel voor een actieve-plek-gerichte overgangsstaat-analoog. Acivicine lijkt zich te binden aan een ander nucleofiel residu dan het katalytische nucleofiel van zoogdier-GGT.

GGT wordt reversibel en competitief geremd door l- en d-γ-glutamyl-(o-carboxy)fenylhydrazide (anthglutine, geproduceerd door Penicillium oxalicum) met een Ki van 8 μM, en er wordt geen acute toxiciteit gemeld voor muizen. Verscheidene glutamaatanalogen met een reactieve groep in de buurt van de γ-carboxy werken als irreversibele remmers. 6-Diazo-5-oxo-l-norleucine (DON), O-diazoacetyl-l-serine (l-azaserine) en l-(αS,5S)-α-amino-3-chloor-4,5-dihydro-5-isoxazoolazijnzuur (acivicine of AT-125, geproduceerd door Streptomyces sviceus) zijn krachtige, maar niet-specifieke inactiverende stoffen voor GGT. Acivicine is uitgebreid gebruikt voor de onderdrukking van de activiteit van GGT in vivo , hoewel acivicine zeer toxisch is door de inactivering van een aantal glutamine amidotransferasen die betrokken zijn bij de biosynthese van nucleotiden, aminozuren en aminosuikers . Het serine-boraatcomplex wordt reversibel gebonden aan de γ-glutamylbindingsplaats om GGT te remmen met een Ki van 20 μM . Deze klassieke bevinding heeft geleid tot een krachtige en langzaam bindende remmer, l-2-amino-3-boronobutaanzuur (γ-boroGlu) . GGT wordt geremd met een totale Ki van 17 of 35 nM, maar de remming is nog reversibel. 2-Amino-4-(fluorofosfono)butaanzuur (γ-PFGlu), een glutamaatanaloog met een elektrofiele fosfor die de γ-carboxy vervangt, is een krachtige mechanisme-gebaseerde en active-site gerichte affiniteits-labeling agent van E. coli GGT . Deze verbinding remt GGT snel en irreversibel en vormt een stabiel, anionisch en tetrahedraal transitie-staat-achtig adduct, dat geschikt is voor peptide mapping om het katalytische nucleofiel van E. coli GGT te identificeren (vide infra). Een reeks γ-(monofenyl)fosfono- en γ-fosfonodiester-glutamaatanalogen dienen als mechanisme-gebaseerde remmers die GGT irreversibel remmen door covalente modificatie van zijn katalytisch nucleofiel. Met name de γ-fosfonodiesters die de structurele nabootsing van Cys-Gly en zijn C-terminale carboxylgroep bevatten, vertonen buitengewoon hoge activiteiten tegen menselijke GGT, waarbij de inactiveringssnelheid 130 tot 6000 maal zo snel is als die van acivicine. De remming is selectief voor GGT, en er wordt geen toxiciteit waargenomen. Een van deze remmers is in de handel verkrijgbaar onder de naam ‘GGsTop’ (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Een niet-glutamaat analoog remmer van menselijke GGT is gevonden door middel van high-throughput screening . Deze verbinding bezet de acceptorplaats van het γ-glutamylsubstraatcomplex met een Ki van 17,6 μM. De remmer is species-selectief, maar is omkeerbaar, en enige toxiciteit is gemeld.

De reactie gekatalyseerd door GGT wordt verondersteld te verlopen met een ping-pong mechanisme via een γ-glutamyl-enzym intermediair zoals waargenomen bij serine hydrolasen . Het N-terminale Thr Oγ in de kleine subeenheid is het katalytische nucleofiel waaraan een γ-glutamylgroep is gehecht (zie Structurele Chemie). Het katalytische nucleofiel van GGT werd voor het eerst geïdentificeerd bij E. coli GGT als het N-terminale Thr residu (Thr391) in de kleine subeenheid door peptide mapping van het enzym geïnactiveerd met γ-PFGlu . Dit residu, dat overeenkomt met Thr380 (rattennierenzym) en Thr381 (menselijk enzym), is geconserveerd onder alle GGT’s waarvan de primaire sequenties bekend zijn. Het katalytische nucleofiel van menselijk GGT is geïdentificeerd als Thr381 door peptide mapping van het enzym geïnactiveerd door het γ-(monofenyl)fosfono affiniteitslabel . De door GGT gekatalyseerde reactie begint derhalve met de nucleofiele aanval van het N-terminale Thr-residu in de kleine subeenheid op de γ-carboxy van een donorsubstraat (γ-Glu-Xaa) om Xaa te elimineren. Het aldus gevormde γ-glutamyl enzym reageert met water (hydrolyse) of met aminozuren en dipeptiden (transpeptidatie en autotranspeptidatie) in de snelheidsbepalende stap .

GGT behoort tot de N-terminale nucleofiele hydrolasen (Ntn-hydrolasen), zoals voorspeld op grond van zijn unieke vouwing en het rijpingsproces, waarbij een actieve dimere vorm van het rijpe enzym wordt gegenereerd door post-translationele autokatalytische verwerking van de katalytisch inactieve precursor. Dit wordt bevestigd door gerichte mutagenese en de röntgenstructuuranalyse van bacteriële enzymen (zie Structurele Chemie).