— FRAPcms

FRAP is een fluorescentie microscopie methode voor het bestuderen van de mobiliteit van fluorescent gelabelde moleculen in levende cellen. Het wordt toegepast voor de analyse van molecuuldiffusie binnen de cel, vloeibaarheid van biomembranen, en eiwitbinding.

Principe:

FRAP kan worden uitgevoerd met behulp van een moderne confocale microscoop. Het vereist fluorescente etikettering van het molecuul van belang, door een GFP-tagged antilichaam, bijvoorbeeld. Een typisch FRAP-experiment omvat drie verschillende fasen. Eerst wordt de initiële fluorescentie gemeten in het betrokken gebied. Vervolgens worden de fluorescerende moleculen binnen een geselecteerd gebied gefobleerd. Dit gebeurt door de laserstraal op het betrokken gebied te richten, wat leidt tot intense verlichting en uitdoving van de fluoroforen. Als gevolg hiervan kan een donker gebied in het anders fluorescerende monster worden waargenomen. Tenslotte kunnen fluorescerende moleculen uit de omgeving door het monster diffunderen en de gefobleerde moleculen uitwisselen met intacte moleculen. Dit fluorescentieherstel wordt in de tijd gemeten.

Omdat vele factoren de terugwinningskinetiek kunnen beïnvloeden, moeten de FRAP-experimenten goed worden gepland en moeten de resulterende gegevens zorgvuldig worden geanalyseerd. Vervolgens kunnen de diffusiecoëfficiënt en de mobiliteitsparameters van de moleculen met behulp van wiskundige modellen worden verkregen.