F-actine

Kristalstructuur van F-actine, 2zwh

Draadvormige actine (F-actine) eenheden worden ook microfilamenten genoemd en zijn zeer geconserveerde, eiwitachtige componenten die bijna ubiquitair in eukaryotische cytoskeletten worden aangetroffen. F-actine en andere actine-eiwitten hebben over het algemeen een structurele rol in cellen.

Inleiding

Actine wordt in bijna alle eukaryote cellen aangetroffen en staat vooral bekend om zijn functie als structuur- en translocatie-eiwit. Het heeft ook een ATPase-functie, aangezien het ATP hydrolyseert tot ADP en Pi en bij elke hydrolyse conformatieveranderingen ondergaat. Actine behoort tot de actine superfamilie, waartoe ook andere eiwitten behoren zoals Hsp70(DnaK), Hsc70 en hexokinase, vanwege zijn nucleotide-afhankelijke conformatieverandering. Gezien de overeenkomst tussen het Hsc70-domein van Escherichia Coli en het ATPase-domein van actine, wordt aangenomen dat de twee eiwitten een gemeenschappelijke afstamming hebben. Prokaryoten hebben geen actine, maar wel een actine homoloog, MreB, wat ook leidt tot het idee van een mogelijke gemeenschappelijke voorouder.

Actine komt in twee vormen voor: globulaire actine (G-actine), de vrije monomere eenheden van actine, en filamenteuze actine (F-actine) dat de polymere vorm is. Deze twee vormen bestaan in een dynamisch evenwicht met elkaar doordat ATP-geassocieerde polymerisatie en depolymerisatie voortdurend in de cel plaatsvinden. De monomeereenheden in de F-actine bezitten een vorm die verschilt van de vrije monomere vorm en het is een gevolg van die verandering dat de meer specifieke ATPase-activiteit kan worden waargenomen.

Assemblage

(1J6Z).

G-actine is de vrije monomere vorm van actine die polymeriseert tot F-actine. De structuren van globulaire en filamenteuze actine verschillen op talrijke manieren van elkaar, ondanks het feit dat G-actine F-actine omvat. Wanneer de monomere actine gepolymeriseerd wordt tot F-actine, wordt de eenheid afgeplat. Ook bezit F-actine een ATPase-functie die in G-actine minimaal is. De domeinen en de actieve plaats zijn dezelfde in termen van samenstellende componenten en zullen later worden besproken in termen van de F-actine monomeer.

G-actine lijkt meer liganden in zijn structuur te hebben, buiten de actieve site. Slechts 3 van de 5 worden geacht daadwerkelijk in oplossing te bestaan en bij te dragen tot de polymerisatie van G-actine tot F-actine. Deze voorstelling van G-actine bezit ook een molecule die in sommige actinekristallijne structuren wordt waargenomen, maar niet noodzakelijkerwijs. De waargenomen molecule op Cys374, werd gebruikt om de polymerisatie-activiteit te blokkeren, zodat het kristal van G-actine kon worden waargenomen

De vorming van F-actine is een dynamisch proces van assemblage en demontage dat “treadmilling” is genoemd. De overgang tussen G- en F-actine begint met een gestabiliseerd oligomeer van ATP-actine-eenheden dat wordt gevormd door een nucleatie-condensatie-type vouwpatroon. Vervolgens worden ATP-monomereenheden aan beide uiteinden toegevoegd, maar door een verschil in ladingspolariteit in de twee uiteinden vindt bij voorkeur toevoeging plaats aan wat het “plus-(+)-uiteinde” of het “weerhaak-uiteinde” wordt genoemd. Aan het andere uiteinde, het “min (-) uiteinde” of het “spitse uiteinde”, is er preferentiële dissociatie van actine-eenheden.

Na aanhechting van het ATP-gebonden actine vindt hydrolyse van het ATP plaats, waardoor de aan ADP en Pi gebonden toestand ontstaat. Het daaropvolgende verlies van een Pi laat de ADP-actine toestand achter. Omdat aan beide uiteinden monomere eenheden kunnen worden toegevoegd of verwijderd, kan de assemblage van F-actine worden beschreven in termen van evenwicht. Maar omdat de snelheid van de ATP-actine-associatie tienmaal zo hoog is als die van de ADP-actine-dissociatie, lijkt f-actine vooruit te bewegen, of “treadmilling”. ADP-actine monomeren dissociëren aan het min-uiteinde en worden gerecycleerd tot ATP-actine zodat polymerisatie aan het plus-uiteinde opnieuw kan plaatsvinden.

Structuur

Geschiedenis van de structuur

Het F-actine eiwit werd ontdekt door Straub in 1942. De structuur werd gespeculeerd op basis van een lage-resolutie röntgenkristallografie die in 1990 werd gevonden door Holmes et al. en in de loop van die tijd werd het “Holmes-model” aanvaard. De G-actinestructuur daarentegen is meer dan 30 keer onafhankelijk bepaald. Een hogere resolutie F-actine model werd pas onlangs in december 2008 in de PDB databank gedeponeerd door Oda et al. .

F-actine Monomeer en Polymeer

(2zwh)

Monomeer

Elke monomere F-actine eenheid heeft, als onderdeel van zijn tertiaire structuur, verscheidene lussen die belangrijk zijn voor zijn assemblage tot het polymere F-actine. Deze lussen ondergaan conformatieveranderingen op basis van de toestand van het gebonden nucleotide of zij dienen als gebieden voor aangrenzende monomere actine-eenheden om zich aan te binden. De lussen fungeren als een “schakelaar” voor conformatie, gebaseerd op de gebonden nucleotide. De DNAse I-bindende lusresiduen (40-50) ondergaan niet alleen conformatieveranderingen die van invloed zijn op de stabiliteit, maar binden ook DNAse I-enzymen en houden volgens speculaties het DNAse I vast. De hydrofobe lus, die residuen 264-273 omspant, en de lus, die residuen 165-172 omspant, fungeren als gebieden waaraan aangrenzende actinemonomere D-lussen zich kunnen binden. Een soortgelijke functie wordt waargenomen voor de residuen (374-375).

Het F-actine molecuul zoals hier afgebeeld bestaat uit 375 residuen (43kDa) en twee liganden, ADP en Ca2+. Het heeft twee grote domeinen gescheiden door een nucleotide-bindende spleet. Afhankelijk van de toestand van het gebonden nucleotide, verandert de meest stabiele conformatie van F-actine. In de ATP- en ADP+Pi-gebonden toestand heeft het een gesloten bindingsspleten. In de alleen aan ADP gebonden toestand heeft het een bredere bindingsspleetEen kenmerkende eigenschap van actine is dat de domeinen ten opzichte van elkaar gedraaid blijven, ondanks de nucleotide-staat-afhankelijke conformatieveranderingen.

F-actinepolymeer (gebaseerd op de F-actinestructuur van Ken Holmes)

Polymeer

F-actin ziet eruit als twee rechtshandige helices, met een geleidelijke draaiing om elkaar heen. In werkelijkheid bestaat het uit herhalingen van 13 actine-eenheden voor elke 6 linkshandige draaiingen, over een lengte van 350 Å.

Nucleotide-status-afhankelijke conformatieveranderingen

De toestand van het gebonden gefosforyleerde nucleotide beïnvloedt welke conformatie het F-actinemonomeer aanneemt. De aanwezigheid van een gamma-fosfaat in de actieve site veroorzaakt de rotatie van een Ser14-residu. Deze verandering leidt tot de verschuiving van een gemethyleerd histidine (HIC73), waardoor de actieve plaats van F-actine verandert en een conformatieverandering in de D-lus optreedt. De HIC73 bevindt zich in de “sensor loop”, of de “schakelaar” voor het koppelen van veranderingen in gebonden nucleotide aan conformationele veranderingen. In ATP-actine en ADP-Pi-actine is de D-lus ongestructureerd. In de ADP-gebonden vorm van F-actine is gewoonlijk een alfa-helix zichtbaar in de D-lus van het monomeer.

Hoewel de alfa-helix niet wordt waargenomen in dit Oda-model van F-actine en niet wordt gezien in sommige andere F-actine studies, wordt door Oda et. al erkend dat de experimentele resultaten zouden kunnen hebben geleid tot een verlengde alfa-helix in het model, in tegenstelling tot een verlengde ongeordende streng als het interagerende segment tussen F-actine monomere eenheden.

Domeinen

(2zwh)

De structuur van een enkele eenheid van F-actine ontstaat uit één polypeptideketen met twee domeinen. De nucleotide bindende spleet, plaats van ATP hydrolyse, kan worden waargenomen tussen de twee domeinen. Beweging van de domeinen maakt de open en gesloten F-actine conformatie mogelijk.

De beweging van de domeinen wordt mogelijk gemaakt door rotatie om de , weergegeven in paars. Volgens Oda e.a. wordt verondersteld dat tijdens de overgang van G- naar F-actine, domein 2 20° kantelt en zich aanpast aan domein 1, waardoor een vlakkere conformatie ontstaat dan de vrije G-actine. Het is niet zeker of deze afvlakking voor of na ATP-hydrolyse optreedt. Holmes geeft een vereenvoudigd beeld van deze domeinbeweging en afplatting.

Stabiliteit

De afgeplatte gevouwen vorm van F-actine vereist andere stabilisatiemechanismen dan de vrije monomere G-actine vorm. De stabiliteit van het F-actine complex wordt bereikt door een reeks waarbij arginine 206, 183, 177 (paars); glutamaat 72 (blauw), aspartaat 187 (groen), 179 en 4-methyl histidine 73 (geel) betrokken zijn. Extra stabiliteit wordt verondersteld voort te komen uit een breuk in de interactie tussen residuen in dezelfde helft van hun respectievelijke domeinen tot een nieuwe interactie tussen waar een veel grotere afstand tussen hen wordt waargenomen.

Als de Pi eenmaal is vrijgegeven, resulteert een conformationele verandering op de D-lus in het “zachter worden” van het F-actine filament. Dat wil zeggen, het maakt het ADP-actine monomeer onstabieler en maakt het vatbaarder voor splitsing

Actieve Site

Bij binding van actine aan het plus eind van het actine filament, wordt de ATPase functie geactiveerd. De conformatieverandering van G- naar F- actine bevordert de katalytische activiteit vanwege de 20° verschuiving die leidt tot een meer gesloten bindingsplaats; deze conformatieverandering wordt ook gestabiliseerd door de diagonale subdomeininteractie tussen Leu110 en Thr194. Als gevolg van deze conformatieveranderingen wordt het van actine dichter bij het ATP-Ca2+ ligand gebracht. Gln137 houdt een watermolecuul vast, en door het in de nabijheid van ATP te plaatsen wordt splitsing van het gamma-fosfaat mogelijk. Het vrijkomen van het anorganische fosfaat gebeurt via de conformatieverandering van de flexibele “D-lus” in een geordende alfa-helix (hoewel niet aangetoond door dit model).

Functie

F-actine vervult een structurele, mechanische en enzymatische rol binnen eukaryotische cellen. Deze functies sluiten elkaar niet noodzakelijkerwijs uit.

De dynamische functies van f-actine zijn sterk betrokken bij celmigratie.

Cytoskelet

F-actine is de meest overvloedige component van het cytoskelet van eukaryoten. Het levert grote hoeveelheden treksterkte, gezien zijn geringe omvang. In gevallen waarin de flexibiliteit als structureel bestanddeel niet gewenst is, kunnen crosslinkages worden gevormd tussen F-actinepolymeren om een grotere stijfheid en steun te geven.

Extensie van F-actine takken leidt tot het fenomeen van het naar voren duwen van het plasmamembraan in lamellopodiale en filopodiale extensie. Dit proces berust op de dynamische evenwichtstoestand waarin G- en F-actine zich bevinden, omdat het de voortdurende polymerisatie van actine-eenheden aan de voorrand is die de membraanverlenging voortstuwt. Zonder de enzymatische ATPase functie van F-actine zou dit proces niet mogelijk zijn.

Actine-Myosine

De relatief vlakkere vorm van F-actine in vergelijking met G-actine maakt het mogelijk dat myosine bij voorkeur F-actine bindt boven G-actine. Dit betekent dat F-actine, en niet G-actine, de functionele vorm van actine is. Het vormt een groot deel van de dunne filamenten in combinatie met myosine om spiercontracties te geven. De structuur van F-actine geeft het een grote weerstand tegen grote krachten, zoals die bij spiercontractie optreden.