EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms

Overzicht van EzColocalization workflow

De workflow voor EzColocalization is verdeeld in vier modules, elk met een eigen tabblad op de GUI. De tabbladen zijn: (i) “Inputs” waar beelden, maskers of regio’s van belang (ROI) lijsten worden geselecteerd en uitgelijnd; (ii) “Cell Filters” waar cellen kunnen worden geselecteerd op basis van fysieke kenmerken en signaalintensiteit; (iii) “Visualisatie” waar heat maps, scatterplots, en metrische matrices (hieronder gedefinieerd) worden gemaakt; en (iv) “Analyse” waar de colokalisatie metrics en outputs worden gekozen. Niet alle modules en niet alle processen binnen een module hoeven te worden gebruikt. Sommige tabbladen hebben een “Preview” knop om een specifieke module uit te voeren in plaats van de “Analyze” knop die alle geselecteerde processen in alle modules uitvoert.

Inputs

Image bestanden, die worden gekozen in de “Inputs” tab (Fig. 1A), moeten zijn: (i) monochromatisch (d.w.z. geen RGB- of CMYK-formaten); (ii) 8-bit, 16-bit of 32-bit; en (iii) in een formaat zoals TIFF dat de originele pixelintensiteitswaarden behoudt. Grote beelden kunnen voor bestandsoverdracht worden gecomprimeerd in een verliesvrij formaat, zoals ZIP of LZW, en vervolgens gedecomprimeerd voor analyses. Naast beelden kan EzColocalization ook maskers en ROI-lijsten voor celidentificatie accepteren (zie hieronder). Als er meerdere beelden voor elk kanaal, moeten de beelden worden gestapeld voor een meer efficiënte analyse in het menu “Stack” (zie ImageJ gids voor meer details24). Beelden in een stack kunnen verschillende beeldvelden of een tijdreeks zijn, maar moeten voor elk kanaal dezelfde afmetingen, vergroting en beeldvolgorde hebben. De input tab biedt ook opties voor het instellen van drempels voor signaalintensiteit en het uitlijnen van verkeerd uitgelijnde beelden van verschillende kanalen (Fig. 1B en aanvullende informatie). Aanbevelingen voor het verwerven van geschikte beelden voor colokalisatie analyse worden gegeven in de Aanvullende Informatie. Opmerking: uitlijning werkt in de veronderstelling dat een geschikte drempel voor signaalintensiteit kan worden gekozen om pixels binnen en buiten de cellen te onderscheiden; als drempelvorming omvat gebieden buiten de cel of slechts een beperkt gebied binnen cellen, dan is de uitlijning kan niet goed functioneren. Om deze reden moeten alle uitlijningen worden gecontroleerd door visueel onderzoek van de ROI’s om te bevestigen dat de juiste cel gebieden zijn geselecteerd.

EzColocalization is in de eerste plaats ontworpen voor een “cel identificatie” kanaal en twee of drie “reporter” kanaal beelden. Het kan echter werken met andere input combinaties (tabel S1). Het celidentificatiekanaal wordt gebruikt om individuele cellen te identificeren, en bijgevolg om intracellulaire en extracellulaire pixels te onderscheiden. De cel identificatie kanaal kan elk type van beeld dat identificatie van de cel grenzen mogelijk maakt met inbegrip van: lichtmicroscopie beelden (bijvoorbeeld fasecontrast25,26 en bright-field), beelden met een reporter die de celmembraan labels of die in het cytoplasma (bijv. Cy5, Fig. 1B), en beelden met een extracellulaire kleurstof die cellen omlijnt. Differentiële interferentie contrast (DIC) beelden te creëren schaduwen die het moeilijk maken voor geautomatiseerde selectie van cellen met behulp van drempel methoden 27, dus voor DIC beelden raden wij aan ROI’s worden gemaakt met behulp van de “selectie tools” in ImageJ om handmatig omlijnen cel gebieden, en vervolgens toe te voegen aan een lijst door te kiezen voor “Toevoegen aan Manager” (in “Selectie” submenu van het menu “Bewerken”). Zodra de ROI’s voor alle cellen van belang in een beeld zijn geselecteerd, kan een binair masker worden gemaakt met behulp van de “Clear Outside” en “Autothreshold” functies van ImageJ.

Cell Filters

De “Cell Filters” tab wordt gebruikt om te helpen cellen te selecteren in beelden (Fig. 2A) en onderscheid intracellulaire en extracellulaire pixels. Cellen worden geïdentificeerd door: (i) een van de drempelalgoritmen van ImageJ24 te kiezen, of handmatig de drempels te selecteren (dit gebeurt door “*Manual*” te selecteren uit een drop-down lijst in het Inputs tabblad en op de knop “Show threshold(s)” te drukken), om regio’s te identificeren die overeenkomen met cellen in het celidentificatiekanaal (Fig. 2B); (ii) het gebruik van watershed segmentatie om aanrakende objecten in de celidentificatie kanaal beelden te scheiden (optioneel) (Fig. 2B); (iii) het selecteren van objecten uit de celidentificatie kanaal beelden op basis van fysieke parameters (Fig. 2C) en signaalintensiteit (Fig. 2D). EzColocalization zal trachten automatisch te detecteren of invoerbeelden een donkere of lichte achtergrond hebben met behulp van scheefheid. Ervan uitgaande dat er meer pixels in de achtergrond dan in de cellen, een beeld met positieve skewness wijst op een donkere achtergrond en negatieve skewness wijst op een lichte achtergrond. Gebruikers kunnen ook handmatig selecteren of de invoerafbeeldingen een donkere of lichte achtergrond hebben in de “Parameters…” opties van het “Instellingen” menu. Cellen die slechts gedeeltelijk binnen een beeld liggen, en daardoor misleidende waarden zouden kunnen opleveren, worden automatisch uit analyses verwijderd.

EzColocalization heeft één optionele “Pre-watershed filter” en acht optionele “Post-watershed filters” (met de optie om er meer te selecteren). Watershed segmentatie kan helpen bij de scheiding van delen en aanraken cellen28, maar het kan ook grote objecten, zoals aggregaten van extracellulaire materiaal verdelen in kleinere fragmenten die dezelfde grootte als cellen. Om dit laatste te voorkomen, kan het Pre-watershed filter worden gebruikt om objecten met grote oppervlakten uit te sluiten van de analyse. Met de knop Preview op het tabblad Cell Filters kunnen gebruikers zien welke objecten op het huidige beeld zullen worden geselecteerd wanneer de minimum- en maximumgrenzen van alle filters worden aangepast. Er zijn twee klassen parameters voor de post-waterkering celfilters (Tabel S2): (i) fysische parameters gebaseerd op metingen van het celidentificatiekanaal; en (ii) signaalintensiteitsparameters van de reporterkanalen. Fysische parameters gelden voor alle kanalen, terwijl signaalintensiteitsparameters alleen van toepassing zijn op het reporterkanaal waarvoor zij zijn geselecteerd (omdat reporters zeer verschillende signaalniveaus kunnen hebben). Naast het filteren op basis van voorgedefinieerde opties in ImageJ, heeft EzColocalization filters voor de “MeanBgndRatio” of “MedianBgndRatio”, die worden berekend door de gemiddelde of mediane signaalintensiteit van pixels binnen een object te delen door de respectieve gemiddelde of mediane signaalintensiteit van extracellulaire pixels.

Visualisatie

Het tabblad “Visualisatie” geeft signalen of metriek in cellen weer als: (i) “heat maps”; (ii) scatterplots; en (iii) “metrische matrices” (Fig. 3A).

Heat maps zijn pseudocolor beelden die de relatieve grootte van de reporter signalen (Fig. 3B) weer te geven. Ze worden gegenereerd door normalisatie en herschaling, zodat de minimale en maximale pixelwaarden zijn 0 en 255 respectievelijk in elke cel, beeld of stapel. Er zijn acht opties voor het kleuren van de heat maps, en de intensiteit waarden voor elke kleur worden verkregen uit de “Show LUT” functie (binnen de “Color” submenu van het “Image” menu in ImageJ). Hittekaarten van cellen zijn geschikt om te bepalen waar elke reporter met de hoogste intensiteit in cellen voorkomt. Image heat maps kunnen laten zien of verschillende cellen binnen een beeldveld wezenlijk verschillende intensiteiten hebben, wat kan wijzen op biologische heterogeniteit of ongelijkmatigheid in de labeling. Stack heat maps kunnen laten zien of cellen in verschillende beelden aanzienlijk verschillende niveaus van signaalintensiteit hebben, wat kan duiden op ongelijkmatigheid in de labeling of metingen op een objectglaasje (bv. door fotobleaching) of veranderingen in het signaal in de tijd (als de stack een tijdreeks is). Opmerking: heat map verschijningen worden beïnvloed door helderheid en contrast settings.

Scatterplots tonen de relatie tussen de signaalintensiteit voor twee of drie reporter kanalen voor individuele cellen en beelden (Fig. 3C). Deze relatie is belangrijk bij het kiezen van de juiste colokalisatie metrische (Supplementary Information). Scatterplots kan ook onthullen heterogeniteit in de lokalisatie patronen 8, die het verwijderen van achtergrondpixels of afzonderlijke analyses voor verschillende celtypes kan vereisen.

Metrische matrices bieden een overzicht van lokalisatiepatronen door het tonen van de berekende waarden van een colokalisatie metriek voor vele drempel combinaties. Metric matrices voor de drempel overlap score (TOS) zijn aangetoond nuttig te zijn voor de analyse van lokalisatiepatronen voor twee reporter kanalen 8,15 (Fig. 3D). Voor de volledigheid, EzColocalization heeft de optie te berekenen metrische matrices voor twee verslaggever kanalen met behulp van vijf andere metrics: drempeloverlap score met logaritmische schaling 8, Pearson correlatiecoëfficiënt (PCC), Manders ‘colocalisatie coëfficiënten (M1 en M2), Spearman’s rang correlatiecoëfficiënt (SRCC), en intensiteit correlatie quotiënt (ICQ)8,15. Colokalisatie voor drie kanalen kan ook worden gemeten met behulp van ICQ, Manders ‘colokalisatie coëfficiënten en TOS29 (Aanvullende informatie).

Drempels voor alle meetmethoden worden gemeten als de top percentiel (FT) van pixels voor signaalintensiteit 8,15. Bijvoorbeeld, FT = 0,1 is de 10% van de pixels met het hoogste signaal. Voor de metriek-matrices wordt FT ook gebruikt om de stapgrootte voor de drempelcombinaties te specificeren. Dat wil zeggen, FT = 0,1 selecteert ook drempelwaarden voor de 10%, 20%, …, en 100% van de pixels met het hoogste signaal. Als FT niet gelijkmatig in 100 deelt, dan is het resterende percentage de laatste stapgrootte. Voor metrieken waarvoor geen drempelwaarde nodig is (d.w.z. PCC, SRCC en ICQ) worden de waarden berekend in de veronderstelling dat alleen de pixels boven de drempelwaarden bestaan. Het metriek-matrixvenster heeft opties om de resultaten op te slaan als tekst of afbeelding, om de FT of het metriektype te wijzigen, de metriekwaarden van individuele cellen als lijst te bekijken en het gemiddelde, de mediaan of de modus van de metriek voor elke drempelcombinatie te berekenen. De knop “Proc” (verwerkt) en “Raw” (ruw) bepaalt of de lijst met gegevens die wordt weergegeven, gekopieerd of opgeslagen met respectievelijk de knoppen “List”, “Copy” of “Save…” de gemiddelde waarde voor de steekproef voor elke drempelcombinatie is (b.v. mediaanwaarde) of alle waarden voor elke cel in de steekproef voor alle drempelcombinaties.

Analysis

Het tabblad “Analysis” heeft drie subtabs (“Analysis Metrics”, “Metrics Info” en “Custom”). De Analyse Metrics subtab heeft zes metrieken voor het meten van colokalisatie voor twee verslaggevers (Fig. 4A) en drie metrieken voor drie verslaggevers (zie vorige sectie). Gebruikers kunnen een drempelwaarde of geen drempelwaarde kiezen voor PCC, SRCC en ICQ. TOS en Manders’ colocalisatiecoëfficiënten moeten een drempel hebben om berekend te kunnen worden. Het subtabblad Info metrics bevat informatie en hulpmiddelen over de in het subtabblad Analysis Metrics gebruikte metrieken (meer details in de Supplementary Information). Drempels kunnen worden geselecteerd volgens de methode van Costes30 of handmatig. In het subtabblad Custom (zie Aanvullende informatie voor meer informatie) kunnen gebruikers hun eigen code in JavaTM schrijven om beelden te analyseren (NB: het gegeven voorbeeld is voor het berekenen van PCC) (Fig. 4B). De “Compileer”-knop test de code en creëert een tijdelijk bestand in de tijdelijke Java-directory en toont het resultaat van het compileren met een “Geslaagd” of “Mislukt” label. Indien succesvol, wordt de gecompileerde aangepaste code opnieuw in het geheugen ingelezen en toegepast op de geselecteerde cellen.

De output van elke analyse is een tabel die de afbeelding en een identificatienummer voor elke cel specificeert (Fig. 4C), en voor elke cel worden waarden gegeven voor: (i) de geselecteerde metriek; (ii) fysische parameters; en (iii) gemiddelde signaalintensiteit voor elk kanaal (indien geselecteerd). Opmerking: “NaN” in de uitvoertabel geeft aan dat er geen waarde kon worden berekend. Gebruikers kunnen ook samenvattende vensters (met het aantal cellen, gemiddelde, mediaan en standaardafwijking voor de geselecteerde metric) (Fig. 4D), histogrammen van metric waarden (Fig. 4E), binaire masker beelden, en een lijst van ROI’s die elke cel de positie en het nummer op elk beeld in de ROI-manager vertegenwoordigen genereren. ROI lijsten en binaire masker beelden kunnen worden opgeslagen voor heranalyse van dezelfde cellen.

Toepassingen van EzColocalization

EzColocalization is ontworpen om te worden gebruikt op een modulaire manier aan te passen van de analyses voor een breed scala van experimenten en behoeften van onderzoekers te vergemakkelijken. Dit gedeelte richt zich op het demonstreren van specifieke tools in EzColocalization om real-world problemen op te lossen in diverse beeld sets.

In de eerste toepassing van EzColocalization, beelden van rat hippocampale neuronen uit de Cell Image Library (CIL:8773, 8775-8788, die worden toegeschreven aan Dieter Brandner en Ginger Withers) worden gebruikt om aan te tonen: (i) het gebruik van een reporter kanaal voor cel identificatie wanneer een experiment niet beschikt over aparte niet-reporter beelden voor cel identificatie, (ii) cel filters voor het selecteren van cellen, en (iii) visualisatie tools voor het kiezen van metrieken. De workflow van de analyse wordt geschetst in Fig. 5A. In de eerste stap, werden twee verslaggever beeldstapels gemaakt: een stapel met beelden waar F-actine is gelabeld (met behulp van een phalloidin peptide geconjugeerd met rhodamine), en de tweede stapel met beelden waar tubuline is gelabeld (met behulp van een antilichaam geconjugeerd met Alexa 488) (Fig. 5B). De interactie van F-actine en tubuline is belangrijk voor de groei en migratie van neuronen31,32. We gebruikten de F-actine beelden voor cel identificatie omdat het aanwezig is in alle cellen en het toont de cel grenzen 8. Individuele cellen werden geselecteerd uit de F-actine beelden door het toepassen van een drempel om cellen te identificeren 24 en met behulp van een cel filter om celresten te verwijderen (let op: parameterwaarden in Fig. 5A).

Nadat de cellen werden geselecteerd, werd de intensiteit van de reporter signalen onderzocht met behulp van cellulaire heat maps en scatterplots. We vonden de reporters niet colokaliseren bij hoge signaalniveaus en er was een complexe relatie tussen de signaalintensiteiten (Fig. 5C,D). Vanwege dit laatste, werd lokalisatie gekwantificeerd met behulp van Manders ‘M1 en M2 en TOS (Aanvullende informatie). M1 en M2 werden geëvalueerd bij drempels geselecteerd door Costes ‘methode voor de cel geschetst in Fig. 5B, en de waarden waren 0,289 en 0,995 respectievelijk. Deze waarden worden gewoonlijk geïnterpreteerd als indicatie dat tubuline een hoge colokalisatie met F-actine heeft, en F-actine een lage colokalisatie met tubuline. De TOS-waarden werden geëvalueerd door het genereren van een metrische matrix met mediane TOS-waarden. De matrix toonde colokalisatie, anticolokalisatie en niet-colokalisatie bij verschillende drempels voor de signaalintensiteiten van tubuline en F-actine (Fig. 5E). Op plaatsen in cellen waar F-actine en tubuline de hoogste intensiteit signaal (top 10% van de pixels voor elk kanaal), de mediane TOS waarde is -0,36 (n = 20). Deze negatieve waarde wijst op antikolokalisatie, wat consistent is met de indruk verkregen uit de hittekaarten en scatterplots, en met andere rapporten8.

In de tweede toepassing werden beelden van Saccharomyces cerevisiae die mitose ondergaan, verkregen uit de Cell Image Library33 om te demonstreren: (i) celidentificatie via handgetekende contouren (voor experimenten waarbij geautomatiseerde methoden van celidentificatie niet kunnen worden toegepast); en (ii) beelduitlijning. De reporter ingangen waren een beeld van een wildtype stam (“controle”; CIL: 13871) dat de BFA1 eiwit dat TEM1 ladingen op de spoel pool lichaam heeft, en een beeld van een stam zonder de BFA1 eiwit (∆bfa1 deletie mutant; CIL: 13870). In deze reporterbeelden brachten cellen het TEM1-eiwit tot expressie, gefuseerd met GFP, en was het DNA gelabeld met DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenylindool). TEM1 lokaliseert naar spindel pool lichamen tijdens mitose en is betrokken bij het triggeren uitgang van mitose 33. De workflow is weergegeven in Fig. 6A. In deze toepassing, werden ROI’s handmatig getekend rond cellen met behulp van de “Freehand” selectie-instrument in ImageJ op DIC beelden. Binaire maskers, die werden gebruikt om celgebieden te selecteren, werden gemaakt door het selecteren van de ROI’s en het gebruik van de “Clear Outside” en vervolgens “Auto Threshold” functies van ImageJ24 (Fig. 6B). De cel gebieden werden gebruikt voor cel-identificatie en om uitlijning te corrigeren tussen de DIC beelden en de verslaggever kanalen met behulp van de “Default” drempel algoritme (Fig. 6C). Na deze cel identificatie en beeld uitlijning, de beelden zijn nu klaar voor visualisatie en analyse, zoals beschreven in het vorige voorbeeld.

In de derde toepassing, beelden van hele volwassen Caenorhabditis elegans verkregen uit de Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC012v1, M14)34 werden gebruikt om aan te tonen dat: (i) EzColocalization kan analyseren colokalisatie in hele organismen, en (ii) “cel” filters kunnen individuele organismen selecteren op basis van reporter signaalintensiteit. De beelden in dit voorbeeld zijn van dezelfde dataset gebruikt in onze studie het beschrijven van TOS (maar het zijn niet dezelfde beelden) 8. De workflow is weergegeven in Fig. 7A. Contouren van individuele C. elegans werden getekend in ImageJ op helder-veld beelden ROI’s te creëren, en de ROI’s werden toegevoegd aan de ROI manager voor “cel” identificatie. GFP uitgedrukt uit de clec-60 promotor in de voorste darm was reporter 1 en mCherry uitgedrukt uit de myo-2 promotor in de keelholte, dat is een orgaan naast de voorste darm 35, was reporter 2. Cel filters voor fysieke parameters waren onnodig omdat alleen die objecten geschikt C. elegans geacht had contouren getrokken rond hen in de eerste plaats. Echter, cel filters voor signaalintensiteit nodig waren omdat sommige C. elegans had een laag GFP-signaal, mogelijk te wijten aan transgene silencing36,37 (Fig. 7B). Latere visualisatie en analyse kan worden uitgevoerd zoals beschreven in de eerste application.

In de vierde toepassing, tonen we de analyse van colocalisatie voor drie reporter kanalen. De workflow was hetzelfde als voor twee reporter kanalen, behalve “3 reporter kanalen” werd eerst geselecteerd in de “Instellingen” hoofdmenu (Fig. 8A). Beelden werden verkregen uit de Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC025, versie 1, Image set: 37983, afbeelding: p23_s9) van U2OS botkankercellen (n = 66)38. De drie reporter beelden hadden DNA, endoplasmatisch reticulum (ER) en mitochondriën respectievelijk gekleurd met Hoechst 33342, concanavalin A / Alexa Fluor488 conjugaat, en MitoTracker Deep Red (bovenste rij, Fig. 8B). Celidentificatie werd uitgevoerd met een beeld van het plasmamembraan gelabeld met tarwekiemagglutinine (WGA)/Alexa Fluor 555 conjugaat (linksboven, Fig. 8B). Opmerking: het beeld had ook het Golgi-apparaat en F-actine netwerk gelabeld38. Het plasmamembraan werd getraceerd met behulp van de veelhoek selectie-instrument in ImageJ om ROI’s voor de individuele cellen te creëren, en de ROI manager met de ROI’s werd geselecteerd voor cel identification.

De lokalisatie patronen werden gevisualiseerd op dezelfde manier als voor twee reporters, behalve dat: (i) er zijn drie sets van warmte kaarten voor de verslaggevers in plaats van twee (onderste rij, Fig. 8B), en (ii) scatterplots en metrische matrices zijn in drie dimensies (Fig. 8C-F). Er is de optie in de Visualisatie tab en de Analyse tab (Fig. 8G) om colokalisatie te meten voor de drie reporters met behulp van ICQ, TOS of Manders ‘M1, M2 en M3 metrics. Van de drie metrieken, vonden we dat TOS was de gemakkelijkste te interpreteren. TOS heeft een enkele waarde voor het meten van de colokalisatie van alle drie de reporter signalen, en het toonde duidelijk de reporter signalen voor de kern, mitochondriën en ER overlapte bij lage drempels (dat wil zeggen bij hoge FT waarden is er colokalisatie; rode kleur in Fig. 8E) en niet overlappen bij hoge drempels (dat wil zeggen bij lage FT waarden is er anticolokalisatie; blauwe kleur in Fig. 8E). Deze waarnemingen zijn consistent met de kern, mitochondriën en ER organellen overlappen aan hun randen (waar het signaal van hun reporters typisch lager is) als gevolg van bekende fysieke interacties, maar niet in hun centra (waar het signaal van hun reporters typisch hoger is) omdat ze afzonderlijke structuren in cellen zijn39,40,41.