Evolutionary analysis of gyrA gene from Neisseria meningitidis bacterial strains of clonal complex 4821 collected in China between 1978 and 2016

Evolutionary analysis of 77 gyrA nucleotide sequences from CC4821 N.meningitidis stammen

Zevenenzeventig de novo gyrA sequenties van CC4821 N.meningitidis werden geanalyseerd in de context van 149 publiek beschikbare gyrA sequenties (vermeld in Additionele Tabel 1). Met de resulterende dataset van 226 gyrA nucleotidesequenties werd een fylogenetische boom geconstrueerd (Fig. 1). Een soortgelijke boom werd verkregen met behulp van de maximale waarschijnlijkheid (ML) methode (Additional Figure 1). De nucleotide sequenties divergeerden significant met een totale p-afstand van 0,045 (Tabel 1). Een overzicht van de boom toonde aan dat de sequenties van CC4821 N.meningitidis-stammen (in rood in Fig. 1) dwars door de boom werden gevonden, wat aantoont dat het gyrA-gen binnen deze stammen relatief divergent was.

Neighbor joining phylogenetic tree of 226 gyrA gene sequences from Neisseria strains. De stamnaam wordt als volgt aangegeven: soortnaam-GB ID-stam ID-ST-CC-Serogroep-land van verzameling-jaar van verzameling-CIP-resistentiefenotype. Ontbrekende informatie wordt aangegeven met een lege spatie. Bijvoorbeeld: N.meningitidis-AM889136.1-alpha14-ST53-CC53-cnl-Duitsland-1999 S; Eikenella corrodens-CP034670.1-KCOM3110—-Zuid-Korea-2017. De sequentienamen van CC4821 N.meningitidis-stammen zijn aangegeven in rood lettertype. De 77 sequenties die in deze studie zijn gegenereerd, zijn onderstreept. De sequenties van 9 referentiestammen zijn aangegeven met een zwarte stip. Bootstrap-waarden > 70% zijn aangegeven. Bootstrap-waarden < 70% zijn tussen haakjes aangegeven wanneer nodig. De 9 genetische groepen die in deze studie zijn geïdentificeerd, worden aangegeven met verticale lijnen tussen haakjes. Het resistentiefenotype van CIP wordt aangegeven met R voor resistentie, S voor gevoelig en I voor intermediair resistentiefenotype

Van de 226 geanalyseerde sequenties werd bijna 62% van de sequenties (140) bovenaan de boom aangetroffen, zonder significante bootstrapwaarde (Fig. 1). Deze sequenties waren zeer homogeen, met een p-afstand van 0,003 (Tabel 1). De overige 86 sequenties waren meer divergent, met een p-afstand van 0.066 ten opzichte van de sequenties die in de top van de boom gegroepeerd waren. De meeste knooppunten betreffende deze 86 sequenties hadden een bootstrap waarde > 70%. Bovendien was de p-afstand binnen deze groep van 86 sequenties 0.09, wat aantoont dat deze sequenties onderling sterk divergeerden. Aangezien de belangrijkste knooppunten van de boom een bootstrapwaarde > 80% hadden, besloten wij de sequenties willekeurig in 9 verschillende genetische groepen onder te brengen (Fig. 1; Tabel 1). Deze 9 groepen werden ook gevonden in de ML boom (Additional Figure 1). De gyrA-sequenties van CC4821-stammen werden gevonden in 6 van deze genetische groepen, namelijk groep 1, 2, 3, 5, 6 en 8.

Groep 1 bestond uit 2 sequenties, N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-Cina-2005 en N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009. Deze groep werd ondersteund door een bootstrap van 100% die suggereert dat deze 2 sequenties sterk verschilden van de rest van de sequenties. De sequenties deelden 7 aminoveranderingen (tabel 1, aanvullende tabel 2). De lange tak die correspondeert met de sequentie van N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009 suggereerde echter dat deze sequentie ook significant verschilde van N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 en dit werd bevestigd door een p-afstand van 0,06 tussen deze 2 sequenties (Tabel 1).

Groep 2 bestond uit 2 sequenties van N.meningitidis-stammen die in 2007 en 2011 in de provincies Gansu en Guangxi in China werden verzameld, namelijk N.meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R en N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011.

Groep 3 bestond uit één enkele sequentie, namelijk N.meningitidis-MK930402-231003-ST12300-CC4821-B-China-2009. De met deze sequentie corresponderende knoop werd ondersteund door een bootstrapwaarde van 80%. Bovendien was de laagste p-afstand tussen deze sequentie en de andere geanalyseerde sequenties 0,032, wat aantoont dat deze sequentie significant divergeerde ten opzichte van de rest van de geanalyseerde sequenties (tabel 1).

Groep 5 bestond uit 26 sequenties, voornamelijk van N.meningitidis, waaronder 9 van CC4821. Een subgroep van 7 sequenties, ondersteund door een bootstrap van 100%, bevatte 5 sequenties van N.lactamica. Interessant is dat N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 clusterde met N.lactamica-sequenties met een bootstrap van 100% en een lange vertakking.

Groep 6 bestond uit 27 sequenties van N.meningitidis (8 van CC4821) en 1 sequentie van N. cinerea, namelijk N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294, die een knooppunt deelde met N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R. De N.cinerea-sequentie vertoonde echter een lange vertakking die wees op een aanzienlijke divergentie ten opzichte van de N.meningitidis-sequentie. Op basis van de beschikbare gegevens bleken de sequenties van groep 6 afkomstig te zijn van stammen die resistent waren tegen CIP. Deze stammen deelden echter geen unieke aminozuursubstitutie, wat suggereert dat er geen gemeenschappelijke marker was voor het resistentiefenotype van deze stammen (aanvullende tabel 2).

Groep 8 bevatte de meeste van de N.meningitidis-sequenties (64%) die in dit verslag zijn geanalyseerd. De stammen werden verzameld in de laatste 88 jaar in 13 verschillende landen van 4 continenten. Ondanks de aanzienlijke tijdspanne en de geografische spreiding waren deze sequenties met een p-afstand van 0,003 sterk geconserveerd. Bovendien waren deze sequenties afkomstig van stammen van 68 ST’s, 24 CC’s, 9 serogroepen, waaronder de referentiestam 053442. In het algemeen toonden deze waarnemingen aan dat het gyrA-gen onder de meeste N.meningitidis-stammen sterk geconserveerd was, ondanks verschillende genetische kenmerken, geografische locaties of verzameltijd.

Analyse van de divergentie binnen het GyrA-eiwit

De aminozuurdivergentie binnen het GyrA-eiwit werd geanalyseerd onder 129 unieke sequenties (aanvullende tabel 2). Tweehonderdzevenenvijftig divergerende posities werden geïdentificeerd onder de 931 aminozuren die in de uitlijning voorkwamen (Fig. 2). Hoewel deze plaatsen over het gehele eiwit werden gevonden, bleek de verdeling van de divergentie niet willekeurig te zijn. Twee regio’s waren namelijk sterk geconserveerd, van positie 530 tot 620, en een kleinere regio tussen 300 en 330. Volgens het eiwit van E.coli komt de eerste regio overeen met het einde van het amino-einddomein en het begin van het carboxy-einddomein. De tweede regio komt overeen met het torendomein van het eiwit op basis van de 3D-modelstructuur (fig. 2).

Aminozuurdivergentie tussen het GyrA-eiwit op basis van 129 unieke sequenties. De posities binnen de 932 aminozuren lange uitlijning zijn aangegeven op de X-as. Het percentage sequenties met een bepaalde afwijkende positie wordt aangegeven op de Y-as (linkerkant). Bijvoorbeeld, 58% van de sequenties hebben een mutatie op positie 91. De divergentie plot werd gegenereerd uit het aminozuur verschil tabel weergegeven in tabel 2. De uitlijning heeft 10 hiaten en het aantal sequenties met hiaten is aangegeven op de rechter as en weergegeven als een zwart vierkant. Een kaart van E.coli GyrA eiwit met structurele en functionele domeinen wordt getoond aan de onderkant ter vergelijking. De kaart werd gegenereerd op basis van de volgende referenties. De GyrA-eiwitsequentie van E.coli en N. meningitidis referentiestam 053442 (GB-ID CP000381) werden vergeleken (aanvullende tabel 4). De bekende CIP-resistente plaatsen in E.coli worden getoond en overeenkomstige posities in N.meningitidis worden aangegeven met een blauwe lijn. Opmerkelijk is dat van de 8 resistente sites die in E.coli zijn gerapporteerd, alleen de posities 83 en 87 divergent zijn in N.meningitidis (sites 91 en 95)

Van de 257 divergente posities werd er geen enkele gedeeld door alle geanalyseerde gyrA-sequenties van CC4821-stammen. Vijf locaties (91, 417, 665, 210 en 288) waren sterk divergent; 40% of meer van de 129 sequenties waren op deze posities gemuteerd. Zo bevatte 48% van de 129 sequenties een gemuteerd residu op positie 417 (fig. 2). Eén positie (91) bleek verband te houden met resistentie tegen CIP; alle stammen die niet gevoelig waren voor CIP waren op deze positie gemuteerd, met ofwel een I, ofwel een F of een V (aanvullende tabel 2).

Identificatie van potentiële resistentiemerkers tegen CIP

Van de 226 geanalyseerde sequenties waren er 174 afkomstig van stammen die getest waren op resistentie tegen CIP (aanvullende tabel 1). Voor deze studie werden 67 stammen getest. Zoals hierboven vermeld, waren alle stammen die niet gevoelig waren voor CIP (hetzij met een resistent fenotype (R in de boom) of een intermediair fenotype (I in de boom)) gemuteerd op positie 91. Daaruit bleek dat een mutatie op positie 91 verband hield met het resistentiemechanisme. Van de 67 in deze studie geteste stammen waren er 49 gemuteerd op positie 91, maar 23 van deze stammen hadden een intermediair resistentiefenotype. Dit suggereert dat andere posities bij het resistentiemechanisme betrokken kunnen zijn. Om aanvullende potentiële markers voor resistentie te identificeren, werden de 226 stammen verder geanalyseerd op elke gemuteerde positie. Een verandering die bij resistente stammen wordt aangetroffen (inclusief intermediair resistentiefenotype) maar niet bij gevoelige stammen, zou in aanmerking komen. Om de analyse echter nog strikter te maken, werd een mutatie die slechts in één stam werd aangetroffen, buiten beschouwing gelaten. In totaal werden 33 sites geïdentificeerd (aanvullende tabel 3; linkerzijde van aanvullende tabel 4). Zo werd H8N aangetroffen in 18 resistente stammen (waaronder 2 met intermediair fenotype) maar in geen enkele gevoelige stam. Alle 226 stammen werden geanalyseerd voor deze 33 posities. Om de analyse nog strikter te maken, werd een mutatie die in ten minste één gevoelige stam werd aangetroffen, buiten beschouwing gelaten. De mutatie D95N die in resistente en gevoelige stammen werd aangetroffen, werd dus niet verder in aanmerking genomen. In totaal werden 39 mutaties (sommige op dezelfde positie, zoals positie 91) geanalyseerd (in groen aan de linkerkant van aanvullende tabel 4). Er werd een mutatieprofiel opgesteld voor de 128 stammen met ten minste één mutatie van belang (aanvullende tabel 3). Zesenveertig verschillende profielen werden geïdentificeerd, wat betekent dat er 46 combinaties van deze 39 mutaties bij alle geanalyseerde stammen waren (rechts in Additionele Tabel 4). Zestien van de 46 mutatieprofielen betroffen CC4821-stammen (nummers in rood in aanvullende tabel 4). Zesentwintig profielen hadden betrekking op stammen waarvan bekend is dat zij resistent zijn tegen CIP (stamnamen in blauw lettertype in aanvullende tabel 4). Van de 39 potentiële resistente markers kwamen de mutaties N103D en T91I het meest voor in de profielen, respectievelijk 29 en 27 keer. Er zij echter op gewezen dat ook andere mutaties goed vertegenwoordigd waren, zoals H8N, I111V, E793Q en A679S, die respectievelijk 23, 21, 18 en 17 keer voorkwamen. Vermeldenswaard is ook dat 45% van de resistente stammen (58 van de 128) alleen de mutatie T91I vertoonden. Aangezien de resistentie-markers oorspronkelijk in E.coli werden beschreven, was een vergelijking tussen gyrA-sequenties van E.coli en de referentiestam N.meningitidis 53.442 noodzakelijk om de positie van deze markers in de E.coli-sequentie te controleren (aanvullende tabel 5).

Recombinatie binnen het gyrA-gen tussen N. spp.

De fylogenetische analyse identificeerde potentiële recombinanten. Zo was groep 1 van bijzonder belang, betreffende N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 en N.subflava-CP031251.1-M18660. Deze 2 sequenties deelden 7 residu veranderingen, niet gezien in andere stammen. Bovendien werden 5 van deze veranderingen waargenomen binnen 30 aminozuren (Tabel 1). Tenslotte werden aminozuurveranderingen die in de ene stam werden waargenomen, niet gezien in de andere stam, zoals positie 740 en 750. Al deze waarnemingen suggereerden een recombinatie tussen deze 2 stammen, die werd bevestigd door een BootScan analyse (Fig. 3a). Drie andere mogelijke recombinaties werden bevestigd door BootScan. Fig. 3b beschreef een recombinatie tussen een CC4821-stam (waarschijnlijk ofwel N.meningitidis-MK930428-421615-ST10235-CC4821-B-China-2016 of N.meningitidis-CP000381.1-053442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R) en N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294 —–. Fig. 3c toonde meervoudige recombinatie-gebeurtenissen tussen N.lactamica-CP031253.1-M17106—– en twee N.meningitidis-stammen, N.meningitidis-KJ415206.1-54-R6—– en N.meningitidis-CP000381.1-53,442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R. Tenslotte was er een recombinatie tussen N.meningitidis-stammen te zien in Fig. 3d. Al met al toonde de recombinatieanalyse aan dat het gyrA-gen van Neisseria-stammen zeer gevoelig is voor recombinatie.

Potentiële recombinatiegebeurtenissen inter- en intra-species tussen Neisseria-stammen. a. Recombinatie tussen N.subflava en N.meningitidis. Een BootScan-plot werd gegenereerd in SimPlot met N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 als query. b. Recombinatie tussen N.cinerea en N.meningitidis. Een BootScan-plot werd gegenereerd in SimPlot met N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R als query. c. Recombinatie tussen N.lactamica en N.meningitidis. Een BootScan-plot werd gegenereerd in SimPlot met N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 als een query. d. Recombinatie tussen N.meningitidis-stammen. Een BootScan-plot werd gegenereerd in SimPlot met N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011 als query. De stam waarvan wordt voorspeld dat hij het meest bijdraagt aan het recombinatieproces (ruggengraat) wordt weergegeven als een rode lijn. De N. meningitidis-referentiestam 053442 (GB ID CP000381) wordt weergegeven als een zwarte lijn. Een functionele kaart voor de referentiestam 053442 is hierboven weergegeven op basis van de functionele kaart van E.coli in fig. 2