Endoplasmatisch Reticulum-Geassocieerde Afbraak (ERAD)

2.1 Eiwitvouwingsproces en herkenning van verkeerd gevouwen eiwitten

Zowat 30% van alle eiwitten en alle transmembraaneiwitten van de cel worden gesynthetiseerd in het ER, dat fungeert als een portaal voor toegang tot de secretorische route via het Sec61 kanaal . Tijdens de translocatie wordt de N-terminale hydrofobe signaalsequentie van nieuw gesynthetiseerd eiwit gesplitst door een peptidase complex. Co- en post-translationele modificaties zoals de vorming van disulfidebindingen, de eerste stappen van N-glycosylering en de verankering van glycofosfatidylinositol (GPI) vinden plaats in de ER.

De oxiderende omgeving van de ER helpt bij de vorming van disulfidebindingen, die de tertiaire eiwitstructuur stabiliseren en de eiwitassemblage vergemakkelijken. Tijdens het vouwproces worden disulfidebindingen gevormd door de oxidatie van paren vrije thiolen op cysteïneresiduen door proteïnedisulfide-isomerasen (PDI’s). PDI’s werken als cycli, en na initiële oxidatie worden disulfidebruggen soms isomeriseerd door PDI en ERp57, dat een thioloxidoreductase is, om de correcte vouwing van eiwitten te stabiliseren. Omgekeerd is de reductie van disulfidebindingen van verkeerd gevouwen eiwitten noodzakelijk voor de retrotranslocatiestap van ERAD. Inderdaad, PDI maakt de retrotranslocatie mogelijk van het simian virüs-40 (SV-40) en cholera toxine . ERdj5, een ER oxidoreductase, vermindert disulfide bindingen en interageert met EDEM (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein) en versnelt ook de stap van retrotranslocatie van SV-40 . ERDJ5 reguleert ook de degradatie van de ziekte-veroorzakende α1-antitrypsine variant (null Hong Kong) .

Vouwing wordt geholpen door moleculaire chaperonen die misvouwing en ontvouwing tegengaan. Chaperon-achtige glycanen binden zich aan N-glycanen en spelen een cruciale rol bij eiwitvouwing en -afbraak. Het is duidelijk dat N-glycosylering, kwaliteitscontrole van eiwitvouwing en ERAD functioneel met elkaar verbonden zijn. Na binnenkomst in het ER wordt een grote meerderheid van de nieuw gesynthetiseerde polypeptideketens N-gekoppeld geglycosyleerd. Het enzym oligosaccharyltransferase herkent de Asn-X-Ser/Thr consensussequentie in het grootste deel van het nascente eiwitmolecuul en integreert covalent een hoge mannose bevattende kernglycaangroep (Glc3Man9GlcNAc2) van dolichol gelokaliseerd op het ER-membraan in het eiwit. Door de zeer korte halfwaardetijd van de getriglycosyleerde vorm van het eiwitgebonden oligosaccharide begint de glycaanverwerking onmiddellijk na de overdracht van de precursorglycangroepen door glucosidase-enzymen. Na splitsing van twee of drie glucosideresiduen kan het ontluikende eiwit een interactie aangaan met lectines voor kwaliteitscontrole, zoals CNX en CLR. Deze interactie blijft behouden tot de splitsing van het resterende glucosideresidu. Nadat het glycoproteïne uit de CNX/CLR-cyclus is losgemaakt, wordt ook het laatste glucose getrimd, waardoor een ongeglycosyleerd substraat ontstaat. Dit brengt de interactie van het substraat met de lectinechaperonen in gevaar. Als het eiwit in dit stadium goed gevouwen is, kan het de ER verlaten voor zijn eindbestemming. Als het glycoproteïne echter nog ongevouwen is, blijft het in het ER en wordt het door UDP-glucose:glycoproteïne glucosyltransferase geherlucosyleerd en teruggekaatst met CNX en CLR, waardoor het eiwit meer tijd krijgt om goed te vouwen. De mechanismen die betrokken zijn bij het beëindigen van reglycosylerings-/deglycosyleringscycli zijn nog niet begrepen. Het is echter duidelijk dat, als de polypeptideketen na herhaalde pogingen tot vouwen zijn rijpe vorm niet kan bereiken, eind-mannose residuen van de kern-glycaanketen geleidelijk worden verwijderd door ER α1,2-mannosidase I (ERMan1). ERMan1 produceert het Man8GlcNAc2-isomeer door een mannose-residu van de middelste tak van N-glycanen te verwijderen. Door dit trimmen worden glycoproteïnen slechtere substraten voor reglycosylering en verlaten ze de CNX cyclus.

De hydrofobe patches van goed gevouwen eiwitten zijn gewoonlijk begraven in het inwendige van oplosbare eiwitten. In verkeerd gevouwen eiwitten kunnen deze plekken echter bloot komen te liggen. Als een eiwit blootliggende hydrofobe oppervlakken heeft, bindt BiP zich eraan om deze aggregatie-gevoelige oppervlakken te verbergen voor goede vouwpogingen door aggregatie te voorkomen. Als het vouwen echter niet lukt of wordt vertraagd, dient een verlengde interactie tussen chaperon en misvouwend eiwit voor een geraffineerd proces waarbij het eiwit wordt overgedragen aan andere chaperonen en/of aan het ERAD-proces.

Het is algemeen aanvaard dat de eerste stap van ERAD selectie is van misvouwen eiwitten door chaperonen. Al in 1999 werd ontdekt dat ERAD-substraten van gist opvallend verschilden in hun behoefte aan het ER-luminale Hsp70, BiP . De afbraak van oplosbare substraten zoals pαF en een mutante vorm van het vacuolaire protease carboxypeptidase Y* (CPY*) waren afhankelijk van BiP, terwijl de afbraak van transmembraaneiwitten Pdr5*p, Ste6-166p, Sec61-2p en Hmg2p op een BiP-onafhankelijke manier plaatsvond. In 2004 werd aangetoond dat substraten met een cytosolisch domein zoals Ste6-166p BiP-onafhankelijk werden afgebroken, terwijl eiwitten met luminale defecten BiP nodig hadden, wat suggereert dat afhankelijk van de topologie van verkeerd gevouwen laesie (ER lumen, ER membraan en cytoplasma) cytosolische of luminale chaperones functioneren in de herkenning en targeting voor de degradatie. Het is duidelijk dat de-mannosylering nodig is voor degradatie van verkeerd gevouwen glycoproteïnen, omdat remming van deze mannose trimmen stabiliseert verkeerd gevouwen glycoproteïnen in de ER . Overexpressie van ERMan1 versnelt de afbraak van N-geglycosyleerde eiwitten. Het resulterende Man8-GlcNAc2 glycoproteïne wordt na dit trimmen een substraat voor EDEM1 (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein 1, Htm1p in yeast)-een mannosidase-gerelateerd lectine in het ER. Verder werd voorgesteld dat verkeerd gevouwen glycoproteïnen interageren met ERManI en EDEM1 voor hun ERAD, en de lectine-carbohydraat interactie bleek cruciaal te zijn voor EDEM substraatherkenning. Hoewel ERMan1 werd voorgesteld als een biologische timer die de ERAD van verkeerd gevouwen eiwitten initieert, toonden recente studies aan dat mannosidases niet alleen verantwoordelijk zijn voor intensieve demannosylering tijdens ERAD, vooral onder niet-basale condities. Onder ER stress (unfolded protein response active) condities, verhoogt de transcriptionele verhoging van EDEM1 de ERAD efficiëntie door het onderdrukken van proteolytische downregulatie van ERMan1 . Het bleek dat EDEMs ook een belangrijke rol spelen in demannosylering van substraten . EDEM1 voorkomt ook reglycosylering en bevordert retrotranslocatie en degradatie van sommige ERAD substraten . Anderzijds, terwijl het mannosidase homologie domein (MHD) van Htm1p noodzakelijk is voor substraat binding, bindt zoogdier EDEM1 verkeerd gevouwen eiwitten onafhankelijk van het MHD domein, en daarom is voor EDEM1 substraat binding wellicht geen mannose trimmen of zelfs glycosylering nodig . Dus, in aanvulling op N-gekoppelde oligosaccharide samenhangen van glycoproteïnen, kan EDEM1 de vouwlaesies van verkeerd gevouwen eiwitten herkennen. Samenvattend zijn EDEMs direct of indirect betrokken bij demannosylering van glycoproteïnen en/of dienen als receptoren die mannose-getrimde proteïnen binden en richten voor ERAD (figuur 1).

Truncering van de eindmannose van tak C legt α-eind α1,6-gebonden mannoseresiduen bloot die fungeren als herkenningssignaal voor ERAD lectines zoals OS9 (Yos9 in gist) en XTP3-B (figuur 2). Via hun mannose-6-fosfaat receptor homologie (MRH) domein herkennen beide eiwitten vooral α1,6-gekoppeld mannose j. Daarnaast herkent OS-9 ook α1,6-gekoppeld mannose e en c.

Verschillende rapporten suggereren dat factoren (EDEMs, OS9 en XTP3-B) die nodig zijn voor substraatherkenning en targeting zich binnen supramoleculaire complexen bevinden en/of interageren met belangrijke ERAD-regulatoren . Bijvoorbeeld, EDEM1 interageert met CNX, ontvangt substraten van CNX cyclus en faciliteert ERAD substraat degradatie zoals NHK-α1-antitrypsine mutant . EDEM1 associeert ook met de componenten van de ER retrotranslocatie machinerie. Er wordt gesuggereerd dat EDEM1 verkeerd gevouwen eiwitten bindt en zijn MHD domein gebruikt om afwijkende eiwitten te richten op het ER-resident glycoproteïne SEL1L eiwit van het Hrd1-SEL1L ubiquitine ligase complex. SEL1L vormt een scaffold voor verschillende luminale substraat-herkenningsfactoren en verbindt deze met Hrd1. OS9 en XTP3-B associëren ook met het Hrd1-SEL1L complex, dat ook BiP en GRP94 omvat. Verder wordt XTP3-B voorgesteld om BiP te verbinden met het Hrd1 complex. Volgens een hypothese functioneren deze drie chaperones (EDEM1, OS9 en XTP3-B) als oligomeren, waarbij een monomeer interageert met het substraat en een ander met het Hrd1-SEL1L complex . Bovendien heeft EDEM1 ook een wisselwerking met Derlins, een transmembraaneiwit, dat een kandidaat is voor translocon; verder is aangetoond dat Derlin2 de interactie van EDEM1 met een cytosolisch AAA-ATPase p97 versterkt, dat ATP-hydrolyse koppelt aan de retrotranslocatie van verkeerd gevouwen eiwitten.

Het is duidelijk dat de substraatherkenningsstap van ERAD een gecompliceerd mechanisme is, waarbij verschillende enzymen en chaperonnes betrokken zijn, die een verschillende maar gecoördineerde rol spelen in ERAD. Bovendien variëren, afhankelijk van het substraat, het aantal en de kenmerken van de betrokken eiwitten. Zo is er bijvoorbeeld sprake van een gecoördineerde rol van EDEM, ERdj5 en BiP bij de afbraak van verkeerd gevouwen eiwitten. Na het verlaten van de CNX-CLR cyclus, trimt EDEM1 verder de Man8-GlcNAc2 glycaan structuur en ERdj5 vermindert disulfaat bindingen. Tegelijkertijd activeert ERdj5 de ATPase activiteit van BiP. ADP-gebonden BiP bindt zich aan het verkeerd gevouwen eiwit en houdt het vast in een retrotranslocatie-componentvorm totdat het overgaat in het retrotranslocatie-complex.

ERAD is ook betrokken bij de kwaliteitscontrole van niet-glycosyleerde eiwitten, die onafhankelijk is van lectine-achtige eiwitten. Immunoglobuline lichte keten (Ig-K-LC), een niet-glycosyleerd ERAD-substraat, wordt op een BiP-afhankelijke manier afgebroken. Okuda-Shimizu en Hendershot hebben een ERAD-route gekarakteriseerd voor dit niet-glycosyleerde BiP-substraat en verschillende eiwit-interactiedynamica’s blijken een rol te spelen in dit proces. Ig-K-LC heeft twee intramoleculaire disulfidebindingen, en zijn volledig geoxideerde vorm heeft niet de mogelijkheid om van het ER naar het cytoplasma over te gaan. BiP interageert slechts met de gedeeltelijk geoxideerde vorm van het Ig, waardoor de volledige oxidatie van Ig-K-LC wordt voorkomen en het Ig-K-LC gemakkelijker uit het ER kan vrijkomen. Verder is een transmembraan UBL-domein-bevattend eiwit, homoCys-responsive ER-resident protein (HERP), geïmpliceerd als een receptor voor niet-geglycosyleerde BiP-substraten. HERP interageert met Derlin1, en het gedeeltelijk geoxideerde Ig-K-LC wordt van BiP naar het HERP-Derlin1-Hrd1 complex overgebracht en vervolgens naar proteasomale degradatie geleid. Naast BiP blijkt ook ERdj5 als disulfide reductase belangrijk te zijn voor ERAD van niet-glycosyleerde eiwitten. De niet-glycosyleerde substraten die door BiP worden gevangen, worden overgedragen aan ERdj5 voor de splitsing van disulfidebindingen. Vervolgens worden deze substraten met behulp van BiP overgebracht naar SEL1L voor retrotranslocatie. Naast BiP zijn zowel OS9 als XTP3-B betrokken bij de ERAD van niet-geglycosyleerde eiwitten

.