ELISpot Assay Principle

ELISpot assays maken gebruik van de sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) techniek. Een monoklonaal of polyklonaal antilichaam dat specifiek is voor de gekozen analyt wordt vooraf gecoat op een PVDF (polyvinylideendifluoride)-achterzijde van een microtiterplaat. Naar behoren gestimuleerde cellen worden in de putjes gepipetteerd en de microtiterplaat wordt gedurende een bepaalde tijd in een vochtige 37 °C CO2 -incubator geplaatst. Tijdens deze incubatieperiode bindt het geïmmobiliseerde antilichaam, in de onmiddellijke nabijheid van de afscheidende cellen, afgescheiden analyt. Na het wegspoelen van cellen en ongebonden stoffen wordt een gebiotinyleerd polyklonaal antilichaam, specifiek voor de gekozen analyt, aan de wells toegevoegd. Na een wasbeurt om ongebonden gebiotinyleerd antilichaam te verwijderen, wordt alkalifosfatase geconjugeerd met streptavidine toegevoegd. Ongebonden enzym wordt vervolgens verwijderd door wassen en een substraatoplossing (BCIP/NBT) wordt toegevoegd. Er vormt zich een blauwzwart gekleurd neerslag dat als vlekken verschijnt op de plaatsen waar cytokinen gelokaliseerd zijn, waarbij elke afzonderlijke vlek een afzonderlijke analyt afscheidende cel voorstelt. De vlekken kunnen worden geteld met een geautomatiseerd ELISpot-leessysteem of handmatig, met behulp van een stereomicroscoop.