Elektroporatie en concurrerende transfectiemethoden

Naast de directe introductie van genen vergemakkelijkt elektroporatie de directe overdracht van plasmiden tussen cellen of soorten – bijvoorbeeld van bacteriën naar gist.

Extensieve experimenten worden voortgezet met betrekking tot het gebruik van elektroporatie voor het rechtstreeks toedienen van geneesmiddelen en vaccins aan de cellen van levende organismen. Dit artikel richt zich op niet-medische toepassingen.

Elektroporatie wordt het meest gebruikt om cellen transient te transfecteren, hoewel stabiele transfectie ook mogelijk is. In de biofarmaceutische industrie maakt transiënte transfectie de productie mogelijk van maximaal enkele grammen eiwit voor karakterisering en preklinische studies. In deze toepassing is elektroporatie met behulp van plasmiden betrouwbaar en voorspelbaar gebleken. Elektroporatie produceert op vergelijkbare wijze stabiel getransfecteerde cellen, op voorwaarde dat het DNA in gelineariseerde vorm wordt ingebracht door het eerst met een restrictie-enzym te behandelen.

Electroporatie is stevig verankerd in het arsenaal van transfectietechnieken dat virale vectoren, chemische of op reagentia gebaseerde methoden en mechanische genoverdracht omvat. Virale vectoren zijn de meest gebruikelijke methode voor het genereren van stabiel getransfecteerde cellen voor de vervaardiging van therapeutische eiwitten. Virale vectoren leveren een zeer hoge transfectie-efficiëntie, maar zijn beperkt wat betreft de lengte van het ingebrachte DNA. Virale vectoren worden ook geconfronteerd met problemen in verband met bioveiligheid en mutagenese.

Andere mechanische technieken zoals microprecipitatie, micro-injectie, liposomen, deeltjesbombardement, sonoporatie, lasergeïnduceerde poratie, en pareltransfectie worden alle experimenteel toegepast. Deze mechanische technieken hebben één ding gemeen. Zij verstoren de celmembranen, waardoor DNA de cel kan binnendringen. Bij sommige benaderingen – het “genenkanon” bijvoorbeeld – worden de genen rechtstreeks door het membraan in het cytoplasma geprojecteerd. Van hieruit kunnen de genen naar de celkern migreren.

Extra zijn er hybride technieken die gebruik maken van de mogelijkheden van mechanische en chemische transfectiemethoden. Zo zijn er de laatste tien jaar talrijke artikelen verschenen over magnetofectie, een transfectiemethodologie die chemische transfectie combineert met mechanische methoden. Zo kunnen bijvoorbeeld kationische lipiden worden gebruikt in combinatie met genenkanonnen of elektroporatoren. Het merendeel van de magnetofection literatuur heeft betrekking op de levering van genen en therapeutische moleculen aan levende organismen.

Electroporatie heeft verschillende voordelen: veelzijdigheid (werkt met elk celtype), efficiëntie, zeer lage DNA-eisen, en de mogelijkheid om te werken in levende organismen. Nadelen zijn potentiële celbeschadiging en het niet-specifieke transport van moleculen in en uit de cel.

Maar onder de chemische, mechanische en virale transfectie benaderingen, elektroporatie alleen biedt een redelijke zekerheid van succes, ongeacht de doelcel of organisme.

Bijvoorbeeld, chemische transformatie en elektroporatie zijn twee toonaangevende methoden voor het inbrengen van DNA in Escherichia coli. Bij deze laatste methode moeten de bacteriën eerst “bekwaam” worden gemaakt door bufferzouten te verwijderen om ervoor te zorgen dat de stroom de cellen bereikt, gevolgd door toepassing van de elektrische puls bij 0°C om schade aan de micro-organismen te beperken. Bij chemische transformatie worden de cellen gesuspendeerd in CaCl2, waardoor poriën ontstaan, gevolgd door een hitteschok die DNA in de cellen brengt.

Bij een andere benadering worden kationische lipiden gebruikt om celmembranen open te wrikken. Elektroporatie is minder omslachtig en efficiënter, werkt op meer verschillende celtypes, en leent zich gemakkelijker voor standaardmethoden dan chemische transfectie. Sommige onderzoekers geven echter de voorkeur aan chemische transfectie, omdat hiervoor geen instrument hoeft te worden aangeschaft.

Innovatie mogelijk maken

Hoewel elektroporatie in 1965 voor het eerst werd beschreven, blijft het mogelijkheden bieden voor innovatieve wetenschap op het gebied van instrumentatie, protocollen en experimenten. Ten minste een dozijn universitaire groepen hebben elektroporatie-inrichtingen ontwikkeld op basis van micro-elektromechanische systemen (MEMS). Een voordeel van microchanneled apparaten is dat zij kunnen worden ontworpen om niet meer spanning aan te brengen dan voldoende is om een redelijke macromolecuulintegratie te bereiken. Dat voordeel heeft ook een nadeel. In tegenstelling tot commerciële elektroporatiesystemen werken de chips niet met alle cellen.

Een groep aan het Department of Biomedical Engineering, Louisiana Tech University onder leiding van Shengnian Wang, Ph.D., heeft ontdekt dat gouden nanodeeltjes de prestaties van commerciële elektroporatieapparatuur verbeteren.1 Wang gelooft dat de deeltjes, die sterk geleidend zijn, het geleidingsvermogen van het celmedium verminderen en tegelijkertijd fungeren als “virtuele micro-elektroden” om fosfolipidemembranen te helpen openen. Hij beweert betere prestaties (verbeterde DNA-leveringsefficiëntie) en een hogere levensvatbaarheid van de cellen dankzij lagere poratiespanningen.

Onderzoekers aan de Charité Universitätsmedizin Berlin2 hebben een gecombineerde vierkantpuls-elektroporatiestrategie ontwikkeld voor de reproduceerbare transfectie van cellen. Britta Siegmund, M.D., en medewerkers schorsen cellen in buffer en onderwerpen ze aan een eerste hoogspanningspuls gevolgd door een laagspanningspuls van verschillende elektrische en temporele waarde. Dr. Siegmund beweert dat de levensvatbaarheid vergelijkbaar is met die van standaardelektroporatie en dat de transfectie-efficiëntie tot 95% kan oplopen. Zij concludeert dat de techniek “gemakkelijk kan worden aangepast voor cellen die als moeilijk te transfecteren worden beschouwd.”

Naast de gebruikelijke DNA-overdracht is transfectie gebruikt voor het inbrengen van interfererend RNA in verschillende celtypen. Met deze techniek kunnen de dosering en de efficiëntie van de toediening op gecontroleerde, kleinschalige wijze worden bestudeerd. Problemen met dosering en afgifte hebben praktische RNA-interferentietoepassingen in de therapie geplaagd. Maar ten minste één studie heeft de vraag gesteld of RNA-interferentiegenen het meest effectief worden geïncorporeerd door middel van transfectiereagentia of elektroporatie in primaire cellen.3

Kirsty Jensen, Ph.D., en collega’s aan de Universiteit van Edinburgh vergeleken de werkzaamheid van 11 transiënte transfectiereagenskits en elektroporatie voor het uitschakelen van het immunomodulerende gen voor mediterrane koorts (MEFV) in van runderen afkomstige monocyten-afgeleide macrofagen. De groep testte methodologieën voor kleine interfererende RNA-opname, knockdown van het doelgen, celtoxiciteit, en inductie van de type I interferonrespons.

Electroporatie was ongeveer even effectief in het knock-down maken van MEFV als transfectiereagentia. In tegenstelling tot de reagentia, induceerde electroporatie geen interferon reactie, maar de levensvatbaarheid van de cellen was lager. Kwesties van levensvatbaarheid en transfectie-efficiëntie voor elektroporatie worden over het algemeen beschouwd als een face-value beoordeling van de techniek.

Dr. Jensen concludeerde dat “het gebruik van transfectiereagentia geschikter is dan elektroporatie voor ons werk waarbij de rol van gastheer macrofaaggenen in de reactie op infectie wordt onderzocht,” maar dat “de keuze van transfecteren of elektroporeren van klein interfererend RNA in cellen afhangt van de individuele experimenten.”

In ten minste enkele gevallen waarin de resultaten van elektroporatie suboptimaal zijn, hebben onderzoekers nagelaten andere omstandigheden dan de elektrische pulssterkte te optimaliseren. Zoals onlangs opgemerkt door Hu en medewerkers,4 de effectiviteit van elektroporatie wordt beïnvloed door niet-elektrische factoren zoals cel-of weefseltype en DNA formulering.

Electroporatie is uitgegroeid tot een onmisbare methode voor zowel in vitro en in vivo ontwikkelingsbiologie. Een groot deel van dit werk gebeurt in enkelvoudige cellen, wat bijdraagt tot een model van groot belang voor therapeutica, diagnostiek, toediening van geneesmiddelen en celbiologie. Directe nanoporatie van enkele cellen is moeilijk te wijten aan de onzekerheid die inherent is aan post-poration levensvatbaarheid.

Onderzoekers aan de Northwestern University hebben een single-cell techniek die een hoge levensvatbaarheid en efficiëntie.5 biedt Hun aanpak maakt gebruik van een micro-gefabriceerde cantilever apparaat, de nanofountain probe (NFP). Het levert moleculen aan cellen zachter dan bulk micro-injectie of nanoporatie. Onderzoekers hebben aangetoond NFP-gemedieerde elektroporatie van enkele HeLa-cellen met een transfectie-efficiëntie van beter dan 95%, een levensvatbaarheid van 92%, en kwalitatieve doseringscontrole.

NFP’s vertegenwoordigen een verbetering ten opzichte van oudere transfectietechnologieën met behulp van atoomkrachtmicroscoop sondes. Technieken op basis van atoomkrachtmicroscopie veroorzaken vaak dat cellen hun aanhechting verliezen of scheuren. NFP brengt minder schade toe aan cellen.