Elektroacupunctuur vermindert oxidatieve stress in lever en nieren bij verdoofde ratten

13ORIGINAL ARTICLE
METABOLISM

Electroacupunctuur vermindert de oxidatieve stress in lever en nieren bij verdoofde ratten1

Eletroacupuntura atenua o estresse oxidativo no fígado e no rim em ratos anestesiados

Agamenon Honório SilvaI; Lanese Medeiros FigueiredoI; Paulo Araujo DiasI; Alberico Ximenes do Prado NetoII; Paulo Roberto Leitão de VasconcelosIII; Sérgio Botelho GuimarãesIV

IFellow Master Degree, Department of Surgery, Postgraduate Program, UFC, Ceara, Brazilië. Technische procedures, verwerving en interpretatie van gegevens. Het artikel maakt deel uit van een masterdiploma proefschrift (AHS)
IIGraduate student, UFC, Ceara, Brazilië. Heeft geholpen bij de technische procedures en bij het verkrijgen van gegevens
IIIPhD, Associate Professor, Coördinator, Postgraduate Program, Department of Surgery, UFC, Ceara, Brazilië. Kritische revisie en interpretatie van gegevens
IVPhD, Universitair Hoofddocent, Departement Heelkunde, Hoofd, LABCEX, UFC, Ceara, Brazilië. Tutor, concept, ontwerp, intellectuele en wetenschappelijke inhoud van de studie, schrijven van het manuscript, statistische analyse

Correspondentie

ABSTRACT

DOEL: Onderzoeken van de effecten van een enkele electroacupunctuur (EA) sessie op de acupunten Zusanli (ST-36) en Zhongwan (CV-12) gecombineerd in het reguleren van oxidatieve stress in lever en nieren bij verdoofde ratten.
METHODEN: Achttien gezonde ratten, willekeurig verdeeld over 3 groepen (n=6), werden intraperitoneaal verdoofd met ketamine (90mg kg-1 lichaamsgewicht) + xylazine (10mg/kg lichaamsgewicht): G-1: Controle (verdoving), G-2: verdoving+EA10Hz en 10 mA, 10 Hz) toegepast op de rechter ST-36 en CV-12 acupunten gedurende 30 minuten. G-3 werd op dezelfde manier behandeld, met een tienmaal hogere frequentie (100 Hz). G6PDH activiteit, malondialdehyde (MDA) en glutathion (GSH) niveaus werden spectrofotometrisch bepaald.
RESULTATEN: De lever MDA en GSH concentraties stegen significant bij ratten onderworpen aan EA 10Hz (p<0.01) en EA 100Hz (p<0.001), vergeleken met controle G-1. De lever en nier G6GPH activiteit daalde significant in G-2 (p<0.01) en G-3 (p<0.001) vergeleken met G-1 in EA100Hz ratten. Een soortgelijk patroon werd gevonden in de nier G6PDH activiteit in EA10Hz ratten.
CONCLUSIE: Een enkele 30 minuten durende EA 10/100Hz sessie verbetert lipide peroxidatie en vermindert gelijktijdig oxidatieve stress in lever- en nierweefsels in een ratmodel.

Keywords: Acupunctuur. Elektro-acupunctuur. Lipide Peroxidatie. Oxidatieve Stress. Rats.

RESUMO

OBJETIVO: Investigar os efeitos de uma única sessão de eletroacupuntura (EA) aplicada nos acupontos Zusanli (E-36) e Zhongwan (RM-12) simultaneamente, na regulação do estresse oxidativo no fígado e rins em ratos anestesiados.
METHODEN: Achttien gezonde ratten, willekeurig verdeeld over drie groepen (n = 6), werden onder narcose gebracht met ketamine (90mg/kg lichaamsgewicht) + xylazine (10mg/kg lichaamsgewicht): G-1: Controle (anesthesie), G-2: anesthesie + EA10Hz en G-3: anesthesie + EA100Hz. De ratten in de G-2 groep werden onderworpen aan EA (gepulseerde blokgolven, 10 mA, 10 Hz) toegepast op de rechter ST-36 en VC-12 acupunten gedurende 30 minuten. Bij de ratten van de G-3 groep werd een frequentie gebruikt die 10 maal hoger lag (100 Hz). De activiteit van het G6PDH-enzym en de concentraties van malondialdehyde (MDA) en glutathion (GSH) werden gecontroleerd met spectrofotometrie.
RESULTATEN: Leverconcentraties van MDA en GSH waren significant verhoogd bij ratten onderworpen aan AE met 10Hz (p <0.01) en 100Hz (p <0.001), vergeleken met controle. De G6GPH activiteit was significant verlaagd in G-2 (p <0.01) en G-3 (p <0.001) in lever en nieren vergeleken met de G-1 groep in ratten behandeld met 100Hz.
CONCLUSIE: Een enkele 10/100Hz EA sessie gedurende 30 minuten verhoogt lipide peroxidatie en vermindert gelijktijdig oxidatieve stress in de lever en nieren van gezonde ratten.

Descriptoren: Acupunctuur. Electroacupunctuur. Lipide Peroxidation. Oxidatieve Stress. Ratten.

Inleiding

Manuele acupunctuur (MA) is een van de belangrijkste vormen van behandeling in de traditionele Chinese Geneeskunde. Het gaat om het gebruik van scherpe, dunne naalden die op zeer specifieke punten (acupunten) in het lichaam worden ingebracht. MA wordt al millennia lang gebruikt in oosterse landen en wordt ook in het Westen steeds meer aanvaard door beoefenaars en patiënten1. Elektro-acupunctuur (EA) is een modificatie van deze techniek waarbij kleine elektrische stroomstootjes worden toegepast op naalden die eerder in het lichaam zijn ingebracht en blijkt in veel specifieke klinische en onderzoekssituaties consistentere reproduceerbare resultaten op te leveren2-4. EA toegepast op Zusanli (ST-36) acupunt verminderde lipide peroxidatie in experimentele modellen van ischemie/reperfusie zoals rat ruggenmerg5, hersenen6 en bloedserum7 en varkens hartspier8.

Chakrabarti et al.9 onderzochten het effect van eenmalige, acute (7 pulsen/sec., 0,75 volt) en chronische (4 pulsen/sec., 0,75 volt) elektroacupunctuurbehandeling op afwisselende dagen gedurende een periode van 21 dagen op de leverfuncties van ratten. Twee rugacupunctuurpunten werden samen met ST-36 gebruikt. Na chronische behandeling daalde de waarde van microsomale lipide peroxidatie in de lever aanzienlijk. Aangezien de manuele stimulatie van het acupunt ST-36 in staat is de door sepsis veroorzaakte nierschade te verzachten10 , is het bovendien mogelijk dat de elektrische stimulatie van dat acupunt de concentraties van MDA, een indicator van celmembraanschade, in het nierweefsel kan veranderen.

Fysiologische processen worden gereguleerd door enzymen. NADPH is de belangrijkste intracellulaire reductant en de productie ervan is voornamelijk afhankelijk van glucose-6-fosfaat dehydrogenase. Als de activiteit van G6PDH wordt geremd, is er een gelijktijdige daling van de NADPH-activiteit, een co-enzym dat essentieel is voor de bescherming tegen oxidatieve schade. De integriteit van de cellen en het gehele antioxidantensysteem zijn afhankelijk van een voldoende toevoer van NADPH11. Vele publicaties hebben de effecten aangetoond van MA en EA op het ST-36 acupunt bij het verminderen van oxidatieve stress bij verschillende experimentele ziekten5-9. Bovendien kan het gebruik van ketamine+xylazine, een verdovingsmengsel dat vaak in experimentele studies wordt gebruikt, een zekere mate van oxidatieve stress induceren bij een gezond dier12-13.

Het is eerder aangetoond dat grote hoeveelheden endogene opioïde peptiden worden afgescheiden uit de bijnieren wanneer CV-12 acupunten worden gestimuleerd met behulp van acupunctuur met 2Hz14. Wanneer een hoge frequentie EA (15 Hz) werd toegepast om het acupunt CV-12 te stimuleren, werden meerdere bronnen van endogene opioide peptiden ontdekt15. Daarom wilden we onderzoeken of de toepassing van EA, waarbij zowel de acupunten ST36 als CV-12 werden gestimuleerd, met twee verschillende frequenties, 10 Hz en 100 Hz, het MDA- en GSH-gehalte van de lever en de nieren kan wijzigen en of er een verschil is in lipide peroxidatie en oxidatieve stress tussen 10 Hz en 100 Hz EA bij gezonde knaagdieren.

Methoden

Diervoorbereiding

Mannelijke Wistar ratten met een gewicht van 280-400 g, geleverd door de Faculteit der Geneeskunde Small Animals Breeding Facility (Federale Universiteit van Ceara) werden gehouden onder gecontroleerde omgevingscondities (24 ° C _ relatieve luchtvochtigheid 40%-60%, 12 uur afwisselend licht-donker cycli, voedsel en water ad libitum). Het equivalent van de menselijke rechter ST-36 en CV-12 acupunten werden gekozen voor needling en elektrische stimulatie. De gebruikte acupuntennomenclatuur volgt de WHO-nomenclatuur16. Het ST-36 acupunt bevindt zich 5mm onder de kop van het kuitbeen onder het kniegewricht, en 2mm lateraal van de voorste tuberkel van het scheenbeen. Punctie van het ST-36 acupunt stimuleert de laterale cutane zenuw, de cutane tak van de nervus saphenus, en dieper, de diepe peroneus zenuw17-18. CV-12 acupunt bevindt zich in de anterieure middellijn van de bovenbuik, 20 mm onder de sternale synchondrosis. Deze regio wordt geïnnerveerd door de anterieure cutane tak van de 8ste. intercostale zenuw18.

Materialen

Wegwerp roestvrijstalen naalden (0,20×30 mm, 0,5 cm, DongBang Acupuncture Inc., Chung Nam, Korea) werden gebruikt. De EL-608 elektro stimulator werd gekocht van NKL Produtos Eletrônicos Ltda., Brusque, Santa Catarina, Brazilië.

Experimentele groepen

De dieren werden intraperitoneaal verdoofd met een vers bereid mengsel van ketamine (90mg kg/lichaamsgewicht) en xylazine (10mg kg/lichaamsgewicht). De ratten werden willekeurig ingedeeld in 3 gelijke groepen, als volgt:

* Groep 1 (verdoving) – 6 ratten

* Groep 2 (EA 10Hz) – 6 ratten

* Groep 3 (EA 100Hz) – 6 ratten

Groep 1 (Controle) ratten werden verdoofd zoals beschreven. Zestig minuten later werd de buik van de ratten geopend en de lever en rechter nieren werden verwijderd. Groep 2 (EA10Hz) ratten werden verdoofd zoals beschreven. Na routinematige ontsmetting van de huid met 75% ethanol werden gesteriliseerde wegwerp roestvrij stalen naalden (0,25 mm × 30 mm) loodrecht ingebracht zo diep als 2-3 mm op de juiste ST-36 en CV-12 acupunten. Elektroden werden aangesloten op beide naalden en op een elektrostimulator (NKL EL-608); gepulseerde vierkante golven, 10 Hz, 10 mA werden toegepast gedurende 30 minuten. De stalen werden 30 minuten later genomen. Groep 3 (EA100Hz) ratten werden onderworpen aan EA als Groep 2. Echter, een tien maal hogere frequentie (100 Hz) werd gebruikt.

Biochemische bepalingen

Parameters bepaald waren G6PDH activiteit, malondialdehyde (MDA) en glutathion (GSH) concentraties. Weefselmonsters werden ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard in glazen buisjes bij -70º tot de daaropvolgende bereiding en analyse van lever- en nierhomogenaten. Lipide peroxidatie werd gemeten door malondialdehyde te meten als TBA-reactieve stoffen19. In het kort werden H3PO4 (1%, 3 mL) en een waterige TBA-oplossing (0,6%, 3 mL) toegevoegd aan het 10%-homogenaat (0,5 mL). Het testmedium werd geschud en verwarmd op een kokend-waterbad gedurende 45 min. Na afkoeling werd 4 mL n-butanol toegevoegd en werd het mengsel geschud. Na afscheiding van de n-butanollaag door centrifugeren bij 1200 g gedurende 15 min, werd de optische dichtheid bepaald in een spectrofotometer (Beckman DU 640 B; Beckman Instruments, nu Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) met respectievelijk 535 en 520 nm als absorptiegolflengte. Het verschil tussen de resultaten van de twee optische dichtheidsbepalingen werd genomen als de TBA-waarde en de hoeveelheid malondialdehyde (MDA) in de testis werd berekend, vergeleken met MDA-standaarden en uitgedrukt in micromollen MDA per gram nat weefsel. Het GSH-gehalte werd geschat met de methode van Sedlak en Lindsay20 , die gebaseerd is op de reactie tussen thiolgroepen en 5-5-dithiobis-(2-nitrobenzoëzuur), waarbij een verbinding ontstaat die licht absorbeert bij 412 nm. De hoeveelheid GSH werd bepaald aan de hand van een standaardcurve die gelijktijdig onder dezelfde omstandigheden werd verkregen met verschillende concentraties GSH. De G6PDH-activiteiten werden geschat volgens eerder beschreven methoden21. De enzymactiviteit werd spectrofotometrisch afgelezen.

Gegevensanalyse

Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com) werd gebruikt voor berekeningen en statistische analyse. Alle resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde±SD. Alle gegevens werden getest op verdeling (Kolmorogov-Smirnov test met Dallal-Wilkinson-Lilliefor P-waarde). One-way ANOVA of Kruskal-Wallis test, zoals vereist, werden uitgevoerd om verschillen tussen groepen in MDA en GSH concentraties en G6PDH activiteit in lever- en nierweefsel te bepalen. In de post hoc analyse (Tukey of Dunn), werd een waarschijnlijkheidswaarde van p<0.05 beschouwd om statistische significantie aan te geven.

Resultaten

GSH Assay

Liver GSH concentraties namen significant toe bij ratten onderworpen aan EA 10Hz en EA 100Hz (p<0.001), vergeleken met controle (figuur 1). Vergelijkbare stijgingen in nier GSH concentraties traden op in zowel EA10Hz als EA100Hz groepen (figuur 2). Bovendien namen de lever- en nier-GSH-concentraties significant toe bij met EA100Hz behandelde ratten in vergelijking met de EA10Hz-groep.

MDA Assay

Liver-MDA-concentraties namen significant toe bij ratten die werden onderworpen aan EA10Hz (p<0,01) en EA100Hz (p<0,001), in vergelijking met de controlegroep (figuur 3). Gelijkaardige toenames in nier-MDA-concentraties traden op in zowel de EA10Hz als de EA100Hz groepen (Figuur 4). De nier-MDA-concentraties namen significant toe in de EA100Hz-groep vergeleken met de EA10Hz-groep.

G6PDH Assay

Liver G6GPH-activiteit nam significant af in de EA100Hz-groepen (p<0,001) vergeleken met de controlegroep (figuur 5). Een soortgelijk patroon werd gevonden in de nier G6PDH activiteit in EA10Hz ratten. De nier G6PDH activiteit was niet verschillend in beide groepen (Figuur 6).

Discussie

In ons experiment werd de oxidatieve stress geïnduceerd door het gebruik van ketamine, een dissociatief verdovingsmiddel, dat vaak wordt gebruikt tijdens veterinaire procedures of voor experimentele doeleinden. Alva et al.12 toonden aan dat ketamine leidt tot verhoogde plasmatische stikstofoxideniveaus, metabole acidose induceert, en oxidatieve schade veroorzaakt, echter zonder hepatische toxiciteit te bereiken.

Antiperoxidatieve effecten van laagfrequente EA zijn aangetoond. Siu et al.6 elektrostimuleerden de acupunten GB-20, gelegen op het achterste aspect van de nek, onder het achterhoofdsbeen, in de depressie tussen de musculus sternocleidomastoideus en de musculus trapezius en de ST-36, met meerdere toepassingen vóór cerebrale ischemie en concludeerden dat 2Hz EA gedeeltelijk de lipide peroxidatie in cerebrale ischemie kon reguleren. GB-20 en ST-36 hadden een vergelijkbare gunstige werking6. In onze studie veroorzaakte het gebruik van EA een significante verhoging van de MDA-concentratie in de lever (Figuur 3) en de nier (Figuur 4) in de EA10Hz en EA100Hz groepen. Extra verhoging van de lipide peroxidatie trad op in de EA100Hz groep vergeleken met de EA10Hz ratten. Dit suggereert dat de nier vatbaarder is voor lipide peroxidatie dan de lever. Het lijkt erop dat het gebruik van elektrische stimulatie met gebruikmaking van hoge frequenties in een enkele sessie de peroxidatie van lipiden in dit ratmodel verhoogt.

Yu et al.22 evalueerden de rol van naaldstimulatie van vier verschillende acupunten: GB-34 (Yanglingquan), LR-3 (Taichong), ST-36 (Zusanli) en SP-10 (Xuehai) acupunten op het reguleren van oxidatieve stress in het nigrostriatale systeem in de 6-hydroxydopamine lesioned rat en concludeerde dat acupunctuurstimulatie de vermindering van GSH niveau evenals de toename van MDA niveau voorkwam.

Zoals wij de effecten van een enkele electroacupunctuur sessie bestudeerden, terwijl in Yu et al.22 evalueerde de effecten van de klassieke acupunctuurbehandeling, tweemaal per dag uitgevoerd gedurende 14 dagen, menen wij dat het gebruik van elektrische stimulatie in een enkele sessie verantwoordelijk zou kunnen zijn voor de toename in MDA niveaus. Anderzijds veroorzaakte EA, gebruikt in een enkele sessie, een significante verhoging van de GSH-concentratie in zowel lever- (figuur 1) als nierweefsel (figuur 2). Het beschermende effect van EA is groter bij hogere frequenties, zoals blijkt uit de verhoogde GSH-concentratie in de nieren van EA100Hz ratten, in vergelijking met EA10Hz dieren.

G6PDH speelt een zeer belangrijke rol in de reactie van de cellen op de oxidatieve stress. Tot voor kort was er een algemene overtuiging dat het belang van dit enzym beperkt was tot menselijke erytrocyten die geen andere NADPH producerende route hebben23. Recente waarnemingen hebben aangetoond dat G6PDH een beschermende rol speelt tegen reactieve zuurstofspecies in eukaryote cellen die alternatieve routes voor de productie van NADPH bezitten24. In deze studie daalde de G6PDH activiteit aanzienlijk in de lever van de EA10Hz en EA100Hz groepen. Een gelijkaardige daling van de activiteit werd waargenomen in de nieren van de EA10Hz-ratten. De GSH-concentraties in de nieren stegen bij EA100Hz-ratten op het ogenblik dat in dezelfde groep een gelijktijdige daling van G6PDH werd aangetoond.

Yu et al.25 hebben aangetoond dat de G6PDH-activering omgekeerd gecorreleerd is met de intracellulaire GSH-niveaus, waarbij gebruik werd gemaakt van celsuspensieculturen van Taxus chinensis. Het is mogelijk dat dierlijke cellen een soortgelijk gedrag vertonen.

Wat de sterke en zwakke punten van deze studie ten opzichte van andere betreft, is er geen gepubliceerde studie die direct kan worden vergeleken met het huidige onderzoek. Ondanks het feit dat peroxidatieve effecten van EA hier werden aangetoond, in tegenstelling tot andere studies6, werd 10 Hz elektrostimulatie niet gebruikt door andere onderzoekers. In gepubliceerde studies werd gebruik gemaakt van laagfrequente EA (2 Hz), in meerdere sessies. In onze studie werd een enkele sessie gebruikt. Anderzijds suggereert de daling van de G6PDH activiteit in de lever en nieren van ratten behandeld met respectievelijk 100 Hz en 10 Hz, samen met een gelijktijdige stijging van de GSH niveaus, na een enkele EA sessie, dat hogere frequenties een betere bescherming tegen oxidatieve stress zouden kunnen induceren. De betrokken mechanismen zijn tot nu toe niet duidelijk. Verdere studies kunnen een nieuw licht werpen op de beschermende effecten van electroacupunctuur.

Conclusie

De verzamelde gegevens ondersteunen de hypothese dat een enkele EA 10/100Hz sessie van 30 minuten de lipide peroxidatie verhoogt en gelijktijdig oxidatieve stress vermindert door verhoging van GSH niveaus in lever- en nierweefsels in een ratmodel.

1. Campbell A. De oorsprong van acupunctuur. Acupunct Med. 2002;20(2-3):141

6. Siu FK, Lo SC, Leung MC. Effectiveness of multiple pre-ischemia electro-acupuncture on attenuating lipid peroxidation induced by cerebral ischemia in adult rats. Life Sci. 2004;75(11):1323-32.

8. Wang XR, Xiao J, Sun DJ. Myocardiale beschermende effecten van electroacupunctuur en hypothermie op varkenshart na ischemie/reperfusie. Acupunct Electrother Res. 2003;28(3-4):193-200.

12. Alva N, Palomeque J, Carbonell T. Nitric oxide induced by ketamine/xylazine anesthesia maintains hepatic blood flow during hypothermia. Nitric Oxide. 2006;15(1):64-9.

14. Lin JG, Chang SL, Cheng JT. Release of beta-endorphin from adrenal gland to lower plasma glucose by the electroacupuncture at Zhongwan acupoint in rats. Neurosci Lett. 2002;326(1):17-20.

15. Lin JG, Chen WC, Hsieh CL, Tsai CC, Cheng YW, Cheng JT, Chang SL. Multiple sources of endogenous opioid peptide involved in the hypoglycemic response to 15 Hz electroacupuncture at the Zhongwan acupoint in rats. Neurosci Lett. 2004;366(1):39-42.

16. Wereldgezondheidsorganisatie (WHO). Standard Acupuncture Nomenclature: a brief explanation of 361 classical acupuncture points and their multilingual comparative list. 2ed. Regionaal kantoor van de WHO voor het westelijk deel van de Stille Oceaan; 1993.

23. Xu Y, Osborne BW, Stanton RC. Diabetes veroorzaakt remming van glucose-6-fosfaat dehydrogenase via activering van PKA, hetgeen bijdraagt tot oxidatieve stress in de niercortex van de rat. Am J Physiol Renal Physiol. 2005;289(5):F1040-7.

24. Salvemini F, Franzé A, Iervolino A, Filosa S, Salzano S, Ursini MV. Enhanced glutathione levels and oxidoresistance mediated by increased glucose-6-phosphate dehydrogenase expression. J Biol Chem. 1999;274(5):2750-7.

25. Yu LJ, Lan, WZ, Chen C, Yang Y. Glutathion levels control glucose-6-fosfaat dehydrogenase activity during elicitor-induced oxidative stress in cell suspension cultures of Taxus chinensis. Plant Sci. 2004;167:329-35.