Echovirus 4 geassocieerd met hand-, voet- en mondziekte

VIROLOGY

Echovirus 4 geassocieerd met hand-, voet- en mondziekte

Echovirus 4 associado à doença de mão, pé e boca

Denise Hage Russo; Adriana Luchs; Bráulio Caetano Machado; Rita de Cássia Carmona; Maria do Carmo Sampaio Timenetsky

Enterische Virussen Laboratorium, Adolfo Lutz Instituut, São Paulo, SP, Brazilië

Correspondentie aan

SUMMARY

Hand-, voet- en mondziekte (HFMD) is een besmettelijke enterovirale infectie die vooral bij kinderen voorkomt en gekenmerkt wordt door vesiculaire palmoplantaire erupties en erosieve stomatitis. Echovirus 4 (EV-4) wordt vaak in verband gebracht met aseptische meningitis. De associatie van HFMD met EV-4 is nog niet eerder gerapporteerd. Twee monsters van een kind van 14 maanden met lichte koorts, zweertjes in de mond, huiduitslag met blaren op de handpalmen en voetzolen werden naar het Enterische Virussen Laboratorium van het Adolfo Lutz Instituut gestuurd. Klinische monsters werden geïnoculeerd in drie verschillende cellijnen, en de monsters die een cytopathisch effect (CPE) vertoonden, werden onderworpen aan een indirecte immunofluorescentiebepaling (IFA) en “één stap” RT-PCR. Agarose gel electroforese van RT-PCR product, toonde een product met 437 bp, dat karakteristiek is voor Enterovirus groep. Echovirus 4 werd geïdentificeerd door IFA. Hoewel HFMD een virale infectie is die voornamelijk geassocieerd wordt met Enterovirus 71 (HEV-71) en Coxsackievirus A16 (CV-A16), tonen onze resultaten een diversiteit aan serotypes aan die gerelateerd zijn aan HFMD en benadrukken het belang van epidemiologisch toezicht op deze ziekte en de complicaties ervan.

Keywords: Hand-, voet- en mondziekte; Enterovirus; Echovirus.

RESUMO

A Doença de Mão, Pé e Boca (DMPB) é uma infecção enteroviral contagiosa que ocorre principalmente em crianças sendo caracterizada por erupções palmoplantares vesiculares e estomatite. Echovirus 4 (EV-4) wordt vaak in verband gebracht met meningitis asséptica. De associatie van DMPB door EV-4 is nog niet eerder beschreven. Twee monsters van een 14 maanden oud kind met koorts, keelafscheidingen en uitslag op de handpalmen en de voeten werden naar het laboratorium voor enterische virussen van het Instituto Adolfo Lutz gestuurd. De monsters werden geïnoculeerd in drie verschillende cellijnen; de monsters die een cytopathogeen effect (CPE) vertoonden, werden onderworpen aan een indirecte immunofluorescentiebepaling (IFI) en een “one step” RT-PCR. Agarose gel electroforese uitgevoerd met het PCR produkt toonde een produkt van 437pb, kenmerkend voor Enterovirus groep. Het serotype EV-4 werd geïdentificeerd door IFI. Hoewel DMPB een virale infectie is die voornamelijk geassocieerd wordt met Enterovirus 71 (HEV-71) en Coxsackievirus A16 (CV-A16), benadrukken onze resultaten de noodzaak van epidemiologische en laboratoriumstudies die zich richten op EV-4 als veroorzaker van DMPB.

INLEIDING

Hand-, mond- en klauwzeer (HFMD) is een veel voorkomende ziekte bij zuigelingen en kinderen onder de 10 jaar en wordt gekenmerkt door koorts, zweertjes in de mond en uitslag met blaren. HFMD begint met lichte koorts, slechte eetlust, malaise en vaak keelpijn. Eén of twee dagen daarna wordt koorts en het ontstaan van zweertjes in de mond waargenomen. Er ontstaan vaak kleine rode vlekjes met blaren die uitgroeien tot zweertjes. Ze bevinden zich meestal op de tong, het tandvlees en de binnenkant van de wangen. De huiduitslag ontwikkelt zich in 1-2 dagen met vlakke of verheven rode vlekken, en sommige met blaren. De uitslag jeukt niet en bevindt zich meestal op de handpalmen en de voetzolen. Ze komt ook voor op de billen. Hoewel sommige mensen met HFMD alleen huiduitslag of mondzweren kunnen hebben4.

Overdracht vindt plaats van mens op mens door direct contact met neus- en keeluitvloeiing of via fecale orale routes. HFMD wordt niet overgedragen op of van huisdieren of andere dieren. Individuele gevallen van HFMD komen wereldwijd voor, het vaakst in de zomer en het vroege najaar4. Verticale verspreiding van moeder op foetus komt ook voor, maar de gevallen lossen op zonder complicaties op lange termijn, besmetting in het eerste trimester kan leiden tot spontane abortus of intra-uteriene groeivertraging. Andere complicaties zijn gemeld, waaronder myocarditis, meningoencephalitis, longoedeem en zelfs de dood16.

De eerste melding van HFMD werd gedaan door ROBINSON & RHODES in 195812. Zij meldden een exantheem met geassocieerde koorts en orale laesies, geconstateerd bij meer dan 60 personen in juni en juli 1957 in Toronto, Canada. Coxsackievirus A16 (CV-A16) werd geïsoleerd uit tweederde van de 27 onderzochte ontlastingmonsters. De volgende gemelde epidemie van Coxsackievirus deed zich voor in Birmingham, Engeland, in de zomer van 1960 en werd beschreven door ALSOP et al.2 die vesiculaire laesies op de handen en voeten met orofaryngeale laesies constateerden en die de eruptie hand-, voet- en mondziekte noemden16.

HFMD wordt veroorzaakt door Enterovirussen, leden van de Picornavirus familie (single-stranded RNA, non enveloped) en wordt het meest geassocieerd met CV-A16 of Enterovirus 71 (HEV-71). Sporadische gevallen die in verband worden gebracht met CV-A4 tot en met CV-A7, CV-A9, CV-A10, CV-B1 tot en met CV-B3 en CV-B5 zijn ook gemeld. Infecties zijn meestal sporadisch, maar er doen zich regelmatig epidemieën voor. De initiële virale infectie vindt plaats in het buccale slijmvlies en het ileale slijmvlies en wordt binnen 24 uur gevolgd door verspreiding naar regionale lymfeklieren. Viremie volgt snel en het virus verspreidt zich naar mondslijmvlies en huid. Ongeveer de 7e dag na infectie kan de serum antilichaamspiegel beginnen te stijgen 6,8.

PATIËNTEN EN METHODEN

Bemonstering: In juli 2003 deed zich een uitbraak van HFMD voor in een kinderdagverblijf in de stad São Paulo, en twee ontlastingmonsters van een mannelijk kind van 14 maanden werden opgestuurd naar het laboratorium voor enterische virussen van het Adolfo Lutz Instituut. Hij vertoonde koorts, zweertjes in de mond, malaise, slechte eetlust en uitslag op de handpalmen en voetzolen. Andere acht kinderen van hetzelfde centrum, in de leeftijd van 10 maanden tot drie jaar, vertoonden soortgelijke symptomen. De diagnose HFMD werd gesteld door andere medische centra (persoonlijke mededeling). Het was onmogelijk om gepaarde serummonsters te verzamelen om de serologische tests tot titratie van antilichamen over te gaan.

Virale isolatie en identificatie: Monsters verzameld binnen zes dagen na de ronde, werden geklaard onder centrifugatie bij 10.000 x g/60 minuten, bij 4 ºC; antibiotica (streptomycine en penicilline ) werden toegevoegd en het supernatant werd bewaard bij -70 ºC tot inoculatie (0,1 en 0,2 ml/tube) op drie verschillende cellijnen: RD (humaan rhabdomyosarcoom), HEp 2 (humaan larynxcarcinoom epidermaal) en Vero (groene apennier) met minimaal essentieel medium (respectievelijk Eagle’s L15, Eagle’s + AANE + piruvate, en 199 medium). Daarna werden de buisjes bij 35-37 ºC bewaard. De culturen werden dagelijks onder een omgekeerde microscoop geobserveerd om het cytopathogeen effect (CPE) te visualiseren. Opeenvolgende passages van het geïnoculeerde materiaal werden gemaakt tot het al dan niet verschijnen van karakteristieke CPE van HEV-infectie7.

Indirecte immunofluorescentietest – IFA: Wanneer de celcultuur ten minste 75% CPE vertoonde, werd het buisje afgeschraapt en werd de celsuspensie op een glasplaatje gespot, dat aan de lucht werd gedroogd en met aceton gefixeerd. Vervolgens werd een indirecte immunofluorescentietest (IFA) uitgevoerd met specifieke monoklonale antilichamen die in de handel verkrijgbaar zijn (Chemicon International Inc., Temecula, CA/USA) tegen genus, groep en HEV-serotypes. De wells van de objectglaasjes werden onderzocht onder een epifluorescentiemicroscoop3.

RT-PCR: Het virale RNA werd geëxtraheerd uit het virusisolaat met Trizol® LS (Invitrogen, cat. 1296-010) en chloroform, volgens de instructies van de fabrikant. Na centrifugatie bij 12.000 xg werd de waterige fase afgescheiden en werd geprecipiteerd met isopropylalcohol. De RNA-pellet werd gewassen met 75% ethanol. Aan het eind van de procedure werd het RNA kort gedroogd en geresuspendeerd met Milli-Q water; RNAsin werd toegevoegd en het RNA werd opgeslagen bij -70 ºC. Het cDNA werd gesynthetiseerd met het geëxtraheerde RNA en het mengsel: 50 mM MgCl2; 10x PCR-buffer; 1,25 nM dNTP; 20 µM/µL primer AS1/S1; 2 µL Super Script II RNAse Reverse Transcriptase; 2,5 U/µL TaqQ DNA Polymerase; 40 U/µL RNAsin en Milli-Q water. De amplificatiereacties werden uitgevoerd in het Gene Amp PCR System 9600 Perkin Elmer thermocycler met de volgende programmering: (42 ºC/1u) + (95 ºC/5 min) + 25 cycli (94 ºC/1 min + 50 ºC/2 min + 72 ºC/1min) + (72 ºC/7min). De PCR-producten werden gescheiden door 1,5% agarose gel, gekleurd met ethidiumbromide, en gevisualiseerd onder UV-licht. De primers gericht op de 5’niet-translated regio amplificeerden een product van 437 bp13.

RESULTATEN

CPE suggestief voor HEV: afronding, inkrimping, nucleaire pyknose, refractiliteit, en celdegeneratie waren gevoelig voor RD en Vero-cellen. De tijd tot het melden van positieve kweken was ongeveer 4-7 dagen.

Een heldere appelgroene fluorescentie in de celkern en/of het cytoplasma van de cellen kon worden waargenomen onder de epifluorescentiemicroscoop, bij 400x, wat wijst op een positieve reactie op echovirus 4 serotype. IFA was negatief voor de andere monoklonale antilichamen.

RT-PCR werd toegepast om het HEV genus te bevestigen. Agarose gel electroforese toonde een product met 437 bp, waarmee HEV werd geïdentificeerd (Fig. 1).

DISCUSSIE

Het etiologische agens dat in deze studie is geïdentificeerd, is HEV dat verschilt van de andere die eerder in verband zijn gebracht met HFMD. Dit syndroom is vaak in verband gebracht met CV-A16 en HEV-71, terwijl in de literatuur geen epidemiologische gegevens zijn gevonden over EV-4 in verband met HFMD.

Terwijl de uitbraak van HFMD in Maleisië (1997) in verband werd gebracht met EV-1, CV-A9 en HEV-711. HFMD veroorzaakt door HEV-71 is in verband gebracht met fatale gevallen van encefalitis tijdens de uitbraken in Maleisië (1997) en Taiwan (1998)17. In de tweede helft van 2000 is naast CV-A16 en EV-7 ook EV-7 aangetroffen als etiologisch agens van HFMD5. In Brazilië brachten MOREIRA et al., (1995) een epidemische exanthemische ziekte in verband met coxsackievirus B3 (CV-B3)10 . Geen enkel rapport over het verband met EV-4 en HFMD in Brazilië, misschien door het gebrek aan klinische verdenking.

De EV-4 wordt in het algemeen in verband gebracht met aseptische meningitis, encefalitis, verlamming, syndroom van Güillan-Barré, exanthem en ademhalingsziekten en is over de hele wereld aangetroffen, vooral als oorzaak van uitbraken van aseptische meningitis: in Cuba van 1972 tot 1999; in Kaapstad, Zuid-Afrika van 1981 tot 1989; in april 1997 in regio’s van Israël en de Palestijnse Autoriteit; in Spanje van 1988 tot 2003; in de herfst van 1982 in Polen, en in Vellore en omstreken in India in 20028,9,11,14,15,18.

Typisch zijn enterovirus infecties ofwel asymptomatisch of resulteren in milde ziekte. Daarom is het aanbevolen om serummonsters te verzamelen om antilichaamtitratie door middel van microneutralisatietechniek uit te voeren, wat een extra parameter zou zijn om te bevestigen dat het geïsoleerde virus verantwoordelijk is voor de ziekte. Samen met de isolatie van de ontlasting, bevestigt de verviervoudiging van de serumtitratie (seroconversie) de acute infectie. Helaas konden serummonsters in deze studie niet worden verkregen.

Ondanks dat, werden alle andere acht kinderen gediagnosticeerd als HFMD door medische centra, gebaseerd op de klinische verschijnselen.

Hoewel dit resultaat niet voldoende zou kunnen zijn om te stellen dat EV-4 een oorzaak van de ziekte was, leek het redelijk om te concluderen dat de signalen en duidelijke klinische verschijnselen de hypothese bevestigen dat het virus niet een passerend virus is.

Het is belangrijk te benadrukken dat CV-A16 en HEV-71, bekend als de belangrijkste veroorzakers van HFMD, gewoonlijk CPE produceren in RD, HEp2 en Vero celculturen; maar in deze studie werden ze niet geïdentificeerd.

Uw werk toont EV-4 aan als veroorzaker van HFMD en suggereert de mogelijkheid dat andere HEV serotypes, uiteindelijk gerelateerd kunnen worden aan HFMD gevallen. Deze gevalsbeschrijving benadrukt de noodzaak van intensiever epidemiologisch en laboratoriumonderzoek naar dit serotype en de surveillance voor andere HEV-serotypen die betrokken zijn bij HFMD, moet in Brazilië worden opgevoerd.

ACKNOWLEDGEMENTS

Wij zijn Dr. Luís Florêncio Salles Gomes bijzonder erkentelijk voor zijn suggesties en kritiek op dit artikel.

1. ABUBAKAR, S.; CHEE, H.Y.; SHAFEE, N.; CHUA, K.B. & LAM, S.K. – Molecular detection of Enteroviruses from an outbreak of hand, foot and mouth disease in Malaysia in 1997. Scand. J. infect. Dis., 31: 331-335, 1999.

2. ALSOP, J.; FLEWETT, T.H. & FOSTER, J.R. – “Hand-foot-and-mouth disease” in Birmingham in 1959. Brit. med. J., 5214: 1708-1711, 1960.

3. BASTIS, D.; SIMONET, S.; PATTERSON, M.A. & NEILL, S. – Identificaties van Enterovirussen door indirecte immunofluorescentie met behulp van monoklonale antilichamen. Klin. diagn. Virol., 3: 38-93, 1995.

4. CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION – Respiratory and Enteric Viruses Branch, 2004. (beschikbaar in http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/Enterovirus/hfhf.htm). Geraadpleegd in mei 2005.

5. CHUA, B.H.; McMINN, P.C.; LAM, S.K. & CHUA, K.B. – Comparison of the complete nucleotide sequences of echovirus 7 strain UMMC and the prototype (Wallace) strain demonstrates significant genetic drift over time. J. gen. Virol, 82: 2629-2639, 2001.

6. GRAHAM, B. – Hand-, voet- en mondziekte. EMedicine Journal, 2002. (beschikbaar in http://www.emedicine.com/derm/topic175htm). Geraadpleegd in mei, 2005.

7. GRANDIEN, M.; FORSGREN, M. & EHRNST, A. – Enterovirussen en reovirussen. in: LENNETTE, E.H. & SCHMIDT, N.J., ed. Diagnostic procedures for viral and rickettsial diseases. 6. ed. Washington, American Public Health Association, 1989. p. 513-578.

8. HANDSHER, R.; SHULMAN, L.M.; ABRAMOVITZ, B. et al. – Een nieuwe variant van echovirus 4 geassocieerd met een grote uitbraak van aseptische meningitis. J. clin. Virol., 13: 29-36, 1999.

9. McINTYRE J.P. & KEEN, G.A. – Laboratory surveillance of viral meningitis by examination of cerebrospinal fluid in Cape Town 1981-9. Epidem. Infect., 111: 357-371,1993.

10. MOREIRA, R.C.; CASTRIGNANO, S.B.; CARMONA, R.C. et al. – An exanthematic disease epidemic associated with coxsackievirus B3 infection in a day care centre. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 37: 235-238, 1995.

11. PIERZCHALA, K.; GRUDZINSKA, B.; BARA, M. & KLOSINSKA, E. – Late sequelae van epidemische virale meningitis. Wiad. lek., 42: 55-158, 1989.

12. ROBINSON, C.R.; DOANE, F.W. & RHODES, A.J. – Report of an outbreak of febrile illness with pharyngeal lesions and exanthem: Toronto, zomer 1957; isolatie van groep A Coxsackie virus. Canad. med. Ass. J., 79: 615-621, 1958.

13. ROTBART, H.A. – Enzymatische RNA amplificatie van de enterovirussen. J. clin. Microbiol., 28: 438-442,1990.

14. SARMIENTO, L.; MAS, P.; GOYENECHEA, A. et al. – Eerste epidemie van echovirus 16 meningitis in Cuba. Emerg. infect. Dis., 7: 887-889, 2001.

15. SATHISH, N.; SCOTT, J.X.; SHAJI, R.V. et al. – Een uitbraak van echovirus meningitis bij kinderen. Indian Pediat., 41: 384-388, 2004.

16. SCOTT, L.A. & STONE, M.S. – Viral exanthems. Derm. Online J., 9: 4, 2003.

17. SHIMIZU, H.; UTAMA, A.; YOSHII, K. et al. – Enterovirus 71 van fatale en niet-fatale gevallen van hand-, voet- en mondziekte-epidemieën in Maleisië, Japan en Taiwan in 1997-1998. Jap. J. infect. Dis., 52: 12-15, 1999.

18. TRALLERO, G. & AVELLÓN, A. – Importancia del diagnostico de los Echovirus desde el punto de vista epidemiológico. Circulación de Echovirus 11 en los últimos años en España – Control Calidad SEIMC, 2004. (Beschikbaar in http://seimc.org/control/revi_viro/echo11.htm). Geraadpleegd in mei 2005