Dephosphorylation

V.B Protein Phosphatases in RPTK Signaling

Tyrosine dephosphorylation is another fast-acting mechanism for the inhibition or termination of signaling from RPTKs. Eiwitfosforylering in signaaltransductie is omkeerbaar, en PTK’s werken in overleg met PTPasen in het bepalen van de initiatie, omvang en beëindiging van tyrosine fosforylering. Downregulatie van RPTK signalering gebeurt niet alleen door directe fosfotyrosine defosforylering van de RPTK zelf (m.a.w. de RPTK is een substraat voor het PTPase), maar ook door defosforylering van een cruciaal stroomafwaarts doelwit van de RPTK. Omdat tyrosine-gefosforyleerde proteïnen, serine- en threonine-gefosforyleerde proteïnen, en zelfs fosfolipiden mediatoren zijn van RPTK-signalering, zijn er voorbeelden van proteïne-serine/threonine-specifieke fosfatasen en fosfoinositide-specifieke lipide fosfatasen die eveneens mediëren van de downregulering van RPTK-geïnduceerde signalering. Enkele voorbeelden volgen, evenals een korte, algemene beschrijving van eiwitfosfatasen.

Alle geïdentificeerde PTPasen bevatten een geconserveerd, ∼280 aminozuur lang PTPase-domein. Hun specifieke katalytische activiteit is ongeveer 1000-voudig hoger en veel minder specifiek dan die van PTK’s. Evenals PTK’s kunnen PTPasen worden onderverdeeld in transmembrane en cytoplasmatische PTPasen. Transmembrane PTPases bevatten extracellulaire regio’s met motieven zoals fibronectine type III-achtige herhalingen, cadherine-achtige herhalingen, en immunoglobuline-achtige domeinen. Zij hebben een enkele transmembraan-overspannende regio, gewoonlijk gevolgd door twee PTPase-domeinen, waarvan er slechts één schijnt bij te dragen tot de katalytische activiteit. Zoals hun extracellulaire regio aangeeft, zijn bepaalde transmembraan PTPasen, zoals PTPκ en PTPμ, betrokken bij homofiele cel-celadhesie, en PTPμ kan cel-celcontacten stabiliseren door de defosforylering van catenines en cadherines. Deze en andere transmembraan PTPasen zijn niet betrokken bij de directe defosforylering van RPTK’s, in tegenstelling tot de cytoplasmatische PTPasen, waarvan er verschillende in staat zijn om RPTK’s direct te defosforyleren.

Het hematopoietisch tot expressie gebrachte, cytoplasmatische eiwittyrosinefosfatase SHP-1 is een van de slechts twee geïdentificeerde SH2-domein-bevattende PTPasen. SHP-1 bindt aan geactiveerde RPTK’s, zoals CSF-1 en Kit/SCF-receptor, via één van zijn twee SH2-domeinen. De SH2 binding van SHP-1, en van het structureel verwante SHP-2 (zie later), verlicht een auto-inhibitoire restrictie op het PTPase domein. Bijgevolg is aangetoond dat zowel de CSF-1 als de Kit/SCF receptoren directe substraten zijn voor SHP-1 en dat SHP-1 belangrijk is voor de normale downregulatie van Kit en CSF-1 receptor signalering. Dit heeft ook fysiologische relevantie. Muizen met het motheaten (me) fenotype, dat te wijten is aan natuurlijk voorkomende loss-of-function (LOF) mutaties in SHP-1, vertonen dan ook talrijke hematopoietische afwijkingen ten gevolge van de hyperproliferatie van myeloïde/monocytaire en mestcellen. De ontregelde CSF-1 en Kit receptor signalering wordt verondersteld deze defecten te veroorzaken, hetgeen wordt ondersteund door studies die aantonen dat het fenotype van dominante white-spotting (W) mutante muizen, die natuurlijk voorkomende LOF mutaties in Kit hebben, wordt verlicht door kruising met de me mutante muizen, en vice versa. Deze en meer recente gegevens die alternatieve transcripten aantonen die ofwel truncaties van SHP-1 veroorzaken, ofwel frameshift-mutaties die resulteren in het verlies van SHP-1 in primaire Kit-expresserende tumorcellijnen, verkregen uit leukemische patiënten, wijzen erop dat SHP-1 een tumorsuppressor is.

Het proteïne tyrosinefosfatase PTP1B is een ander cytosolisch fosfatase, dat betrokken is bij de directe downregulatie van RPTK-signalering. PTP1B bindt aan de geactiveerde insuline- en IGF-1-receptoren via zijn N-terminale katalytische domein door middel van een onbekend mechanisme. Na binding de-fosforyleert PTP1B direct de insuline receptor zelf en het belangrijkste gekoppelde docking eiwit, insuline receptor substraat-1 (IRS-1). Bijgevolg veroorzaakt gerichte deletie van PTP1B in muizen hyperfosforylering van insulinereceptor en IRS-1 en sensitisatie van insulinesignalering. PTP1B defosforyleert ook STAT5a en STAT5b, waardoor hun nucleaire translocatie en transcriptionele activiteit wordt verhinderd. STAT5a en STAT5b worden gefosforyleerd door JAKs die geactiveerd worden door cytokinereceptoren, maar worden ook direct gefosforyleerd door verschillende RPTKs.

Hoewel PTP1B, evenals de receptor-achtige PTPα, en SHP-2, een ander SH2-domein-bevattend fosfatase, ook betrokken zijn bij de verbetering van de signalering stroomafwaarts van RPTKs. PTP1B wordt overgeëxpresseerd in borstkanker cellijnen waar het de defosforylering van Tyr527 aan de C terminus van c-Src veroorzaakt. Dit leidt tot verhoogde Src-kinaseactiviteit, aangezien fosforylering van deze plaats remmend werkt op Src-activiteit via een allosterisch, auto-inhibitoir mechanisme. Het transmembraan RPTPα wordt in vivo tyrosine gefosforyleerd op Tyr789, wat een bindingsplaats creëert voor c-Src, waardoor RPTPα in staat is om Tyr527 in Src in vitro te defosforyleren. Interessant is dat zowel binding als defosforylering van Src afhankelijk zijn van fosforylering op Tyr789, en dat een fosfotyrosine-verplaatsingsmechanisme is voorgesteld voor de activering van Src door RPTPα. Dienovereenkomstig onderdrukken kinase-defectieve of Tyr789Phe mutanten van RPTPα neoplastische transformatie door overgeëxpresseerde RPTPα, en gerichte verstoring van RPTPα veroorzaakt een verminderde activiteit van Src familieleden in cellen van de gemuteerde muizen, hetgeen correleert met verhoogde fosforyleringsniveaus van Tyr527. SHP-2, dat ubiquitair tot expressie komt, associeert in vivo via zijn SH2-domeinen met talrijke RPTK’s en PTK-substraten, waaronder de receptoren voor PDGF, EGF, insuline-achtige groeifactor-1 (IGF-1), en SCF, en het docking-eiwit IRS-1. SHP-2 wordt tyrosinegefosforyleerd als reactie op stimulatie met verschillende groeifactoren, en tyrosinegefosforyleerd SHP-2 bindt aan de receptoren voor PDGF of SCF, alsmede aan het adaptormolecuul Grb2. Van het gebonden SHP-2 is aangetoond dat het selectief tyrosineresiduen in de PDGFR-β defosforyleert die belangrijk zijn voor binding van PI 3′-kinase en de GAP voor Ras. Bovendien remt micro-injectie van blokkerende antilichamen tegen SHP-2 of expressie van SHP-2 SH2-domeinen of van katalytisch inactief SHP-2 de mitogenese gestimuleerd door EGF, insuline en IGF-1. Deze bevindingen suggereren dat SHP-2 een stroomopwaartse activator is van Ras-signalering en andere Grb2-gereguleerde signaalwegen en mogelijk een modulator is van RPTK-geïnduceerde PI 3′-kinase signalering. Net als bij SHP-1 zou binding van SHP-2 zijn katalytische functie kunnen activeren. Van SHP-2 wordt ook beweerd dat het Tyr527 in de C-terminus van Src defosforyleert, hetgeen een extra positieve regulatie van de signalering oplevert.

Verschillende proteïne serine/threonine kinases en substraten daarvan worden gedefosforyleerd door het belangrijke serine/threonine-specifieke fosfatase PP2A. Dit is een cytoplasmatisch en nucleair heterotrimeer fosfatase, bestaande uit een structurele A-subeenheid, een regulatoire B-subeenheid en een katalytische C-subeenheid. PP2A is via zijn regulatoire subeenheid gebonden aan talrijke scaffold-eiwitten, en zijn activiteit wordt strak gereguleerd in de context van geassembleerde scaffolds. Een van de belangrijke substraten in RPTK signalering is het PI 3′-kinase doelwit Akt, een proteïne serine/threonine kinase dat celoverleving bemiddelt, gedeeltelijk door fosforylering van het Bcl-2 familielid Bad. PP2A dephosphorylates the activating phosphorylation site T308 in Akt, crucial for kinase activity. Bovendien zou PP2A de anti-apoptotische molecule Bcl-2 kunnen defosforyleren, waardoor de overlevingsfunctie van deze molecule teniet wordt gedaan. Er zijn talrijke andere substraten voor PP2A geïdentificeerd, waarvan vele belangrijke downstream targets van RPTK’s zijn.

Twee fosfoinositide-specifieke fosfatasen, respectievelijk PTEN en SHIP1/2, de-fosforyleren specifiek de D-3 en de D-5 positie van de inositol ring in PtdIns(3,4,5)P3, een van de belangrijkste effectoren van PI 3′-kinase signalering. Dit gaat RPTK-geïnitieerde PI 3′-kinase signalering tegen, en dienovereenkomstig is PTEN een frequent gemuteerd menselijk tumor suppressor gen gebleken. Inactiverende mutaties in PTEN spelen een rol in bepaalde neuronale, borst- en kiemceltumoren bij de mens, hetgeen geassocieerd wordt met een verhoogde activiteit van Akt.