Clinical Significance of Cannabinoid Receptors CB1 and CB2 Expression in Human Malignant and Benign Thyroid Lesions

Abstract

Het endocannabinoïdesysteem bestaat uit cannabinoïdereceptoren (CB1 en CB2), hun endogene liganden (endocannabinoïden), en eiwitten die verantwoordelijk zijn voor hun metabolisme, nemen deel aan veel verschillende functies die onmisbaar zijn voor de homeostatische regulatie in verschillende weefsels, en oefenen ook antitumorigene effecten uit. De huidige studie had tot doel de klinische betekenis van CB1 en CB2 expressie in humane goedaardige en kwaadaardige schildklierlaesies te evalueren. De expressie van CB1 en CB2 proteïnen werd immunohistochemisch bepaald op paraffine-embedded schildklierweefsels van 87 patiënten met goedaardige en kwaadaardige letsels en werd statistisch geanalyseerd met klinisch-pathologische parameters, de proliferatieve capaciteit van folliculaire cellen, en het risico op recidief geschat volgens het American Thyroid Association (ATA) stageringssysteem. Verhoogde CB1- en CB2-expressie werd significant vaker waargenomen in kwaadaardige dan goedaardige schildklierlaesies ( en , resp.). Verhoogde CB1- en CB2-expressie werd ook significant vaker waargenomen in papillaire carcinomen in vergelijking met hyperplastische nodules ( en , resp.). In kwaadaardige schildklierletsels was de verhoogde CB2 expressie significant geassocieerd met de aanwezigheid van lymfekliermetastasen. Verhoogde CB2 expressie werd ook vaker waargenomen in kwaadaardige schildklier gevallen met de aanwezigheid van capsulaire , lymfatische , en vasculaire invasie , evenals in die met een verhoogd risico van recidief , op een niet-significant niveau , terwijl CB1 expressie werd niet geassocieerd met een van de onderzochte klinisch-pathologische parameters. Onze gegevens suggereren dat CB receptoren betrokken kunnen zijn bij kwaadaardige schildkliertransformatie en vooral CB2 receptor zou kunnen dienen als nuttige biomarker en potentieel therapeutisch doelwit in schildklierneoplasie.

1. Inleiding

Endocannabinoïde systeem (ECS) is een endogeen lipide signaal-inducerend systeem, aanwezig in verschillende menselijke weefsels, dat vele verschillende en niet-gerelateerde functies uitoefent. Talrijke studies hebben aangetoond dat het ECS regulerende effecten heeft op het centrale en perifere zenuwstelsel, het maagdarmkanaal en het immuunsysteem, en betrokken is bij diverse processen, zoals de motiliteit van het maagdarmkanaal, de stemming, de pijnregulatie, het geheugen en de eetlust. Deze functies worden in gang gezet door binding van endogene en exogene liganden aan cannabinoïdereceptoren (CB-receptoren). Naast deze welbekende functies heeft ECS ook een antiproliferatieve werking door modulatie van verschillende signaalwegen, terwijl de activering ervan een prognostische betekenis kan hebben voor de progressie van de tumorontwikkeling.

Er bestaan twee subtypes CB-receptoren, die verschillend verdeeld zijn over de menselijke weefsels. CB1 receptor bevindt zich voornamelijk in het centrale zenuwstelsel, adipocyten, lever, pancreas, skeletspier, en T-lymfocyten . CB2-receptor wordt vooral aangetroffen in immuuncellen, maar ook in neuronen en andere cellen die het centrale zenuwstelsel vormen, zoals astrocyten en microglia, alsook in cerebromicrovasculaire endotheelcellen . De activering van CB-receptoren remt de vorming van cAMP door de koppeling ervan aan Gi proteïnen, hetgeen resulteert in een verminderde proteïne kinase A (PKA-) afhankelijke fosforylering. CB-receptoren koppelen ook aan extracellulair signaal-gereguleerd kinase (ERK) en specifiek aan p42/p44 en p38, waardoor ze deelnemen aan fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) en ceramidesignalering. Andere receptoren zijn ook verbonden met het ECS zoals transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV-1), peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs), en niet-CB1/CB2 G-proteïne-gekoppelde receptors GPR55 .

De ECS-liganden zijn de cannabinoïden, waaronder de bioactieve bestanddelen van de Cannabis Sativa, synthetische CB-imimetische verbindingen, en endogene liganden van CB-receptoren . De belangrijkste molecule van de eerste categorie is Δ9-THC, dat bekend staat om zijn psychoactieve eigenschappen. De andere twee categorieën omvatten synthetische liganden die thans zijn ontwikkeld (CP55940, HU-210, HU-211, ab-cannabidiol, ajulemisch zuur, WIN55,212-2) en endocannabinoïden die door het menselijk lichaam worden geproduceerd en lipide-boodschapperderivaten zijn van arachidonzuur (AA), geconjugeerd met hetzij ethanolamine hetzij glycerol . De belangrijkste van deze moleculen zijn anandamide (AEA) en 2-arachidonoylglycerol (2-AG), maar er zijn ook andere stoffen geïdentificeerd, zoals O-arachidonoylethanolamine (OAE, virodhamine), 2-arachidonoylglycerolether (2-AGE, noladinether), N-arachidonoyldopamine (NADA), en palmitoylethanolamide (PEA) . Naast de CB-receptoren en al hun liganden omvat het ECS ook de essentiële enzymen voor de biosynthese, het transport en de afbraak van liganden.

Naast de ECS-functies voor de handhaving van de homeostase heeft de bovengenoemde wisselwerking tussen het ECS en de belangrijkste oncogene pathways (MAPK/ERK en PI3K/Akt pathway) onlangs aan belang gewonnen en het belang van het ECS in de tumorigenese onderstreept. Bovendien is aangetoond dat cannabinoïden apoptose in kankercellen induceren, de vascularisatie van tumoren remmen via een afname van VEGF, en het invasieve vermogen van kankercellen onderdrukken. Antiproliferatieve effecten overheersen en verschillende studies suggereren dat cannabinoïden potentieel hebben als antitumorale middelen .

Diagnose van schildklier laesies is onlangs toegenomen, niet alleen als gevolg van verbeterde diagnostische technieken, maar ook als gevolg van hun werkelijke incidentie stijging in de bevolking . In feite is schildkliercarcinoom de meest voorkomende maligniteit van het endocriene systeem . Hoewel schildklierkanker meestal volledig kan worden genezen door chirurgie en therapie, sterft nog steeds 10-20% van de patiënten aan recidief of tumorprogressie . Daarom is het essentieel om nieuwe behandelingsstrategieën te ontwikkelen en nieuwe prognostische markers te vinden om het klinische beloop voor elke patiënt te voorspellen en de beschikbare therapeutische modaliteiten dienovereenkomstig aan te passen. In dit opzicht was de huidige studie gericht op het evalueren van de immunohistochemische expressie van CB1 en CB2 receptor in goedaardige en kwaadaardige schildklierlaesies in associatie met clinicopathologische kenmerken gerelateerd aan prognose.

2. Patiënten en Methoden

2.1. Patiënten

Het onderzochte materiaal bestond uit 87 histologisch onderzochte schildklierchirurgische specimens van een gelijk aantal patiënten die schildklierchirurgie hadden ondergaan voor benigne en maligne laesies. Drieënveertig goedaardige (37 hyperplastische noduli en 6 Hashimoto thyroiditis) en vierenveertig kwaadaardige (40 papillaire en 4 folliculaire carcinomen) gevallen werden in de studie opgenomen. Elk neoplasma werd geclassificeerd volgens de histologische classificatie van schildkliertumoren van de WGO. Het risico van recidief werd geschat volgens het stageringssysteem van de American Thyroid Association (ATA). Geen van de patiënten had voorafgaand aan de operatie enige vorm van antikankerbehandeling ondergaan en er was geen klinische voorgeschiedenis van bestraling van hoofd en nek of van andere kanker. Immunohistochemie

Immunokleuringen voor CB1 en CB2 werden uitgevoerd op in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselcoupes van de schildklier met een geit polyklonaal CB1 IgG-antilichaam (N-15, sc-10066, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) en een konijn polyklonaal CB2 IgG-antilichaam (H-60, sc-25494, Santa Cruz Biotechnology). In het kort werden 4 μm dikke weefselsecties ontwaxed in xyleen en door middel van graded alcoholen op water gebracht. Antigeen retrieval werd uitgevoerd door microwaving dia’s in 10 mM citraat buffer (pH 6,1) gedurende 15 minuten (min) op hoog vermogen, volgens de instructies van de fabrikant. Om de endogene peroxidase-activiteit te verwijderen, werden de coupes vervolgens behandeld met vers bereid 0,3% waterstofperoxide in methanol in het donker, gedurende 30 minuten, bij kamertemperatuur. Niet-specifieke antilichaambinding werd geblokkeerd met Eraser en Sniper, specifieke blokkeerreagentia voor respectievelijk geiten- en konijnenprimaire antilichamen (Biocare Medical, Concord, California, USA), gedurende 5 min. De coupes werden gedurende 1 uur (h) bij kamertemperatuur geïncubeerd met de primaire antilichamen tegen CB1 en CB2 in een verdunning van respectievelijk 1 : 300 en 1 : 200 in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), volgens de instructies van de fabrikant. De secties werden vervolgens bij kamertemperatuur geïncubeerd met gebiotinyleerd koppelingsreagens (Biocare Medical) gedurende 10 min, gevolgd door incubatie met peroxidasegeconjugeerd streptavidinelabel (Biocare Medical) gedurende 10 min. De resulterende immuunperoxidase-activiteit werd ontwikkeld met behulp van een DAB-substraatkit (Vector Laboratories, California, USA) gedurende 10 min. De secties werden tegengekleurd met Harris’ hematoxyline en gemonteerd in Entellan (Merck, Darmstadt, Duitsland). Passende negatieve controles werden uitgevoerd door weglating van het primaire antilichaam en/of vervanging ervan door een irrelevant antiserum. Als positieve controle werden weefselcoupes van borstcarcinoom en plaveiselcelcarcinoom van de mobiele tong met bekende CB1- en CB2-expressie gebruikt. Het proliferatievermogen van de folliculaire cellen werd beoordeeld aan de hand van Ki-67 immunohistochemische expressie, zoals eerder beschreven. Evaluatie van de immunohistochemie

Immunohistochemische evaluatie werd uitgevoerd door het tellen van ten minste 1000 tumorcellen in elk geval door twee onafhankelijke waarnemers (Stamatios Theocharis en Paraskevi Alexandrou) geblindeerd voor de klinische gegevens, met volledige overeenstemming van de waarnemers. De monsters werden als “positief” voor CB1 en CB2 beschouwd wanneer meer dan 5% van de tumorcellen binnen de doorsnede positief gekleurd waren. De immunoreactiviteit van de tumorcellen voor CB1 en CB2 werd gescoord volgens het percentage CB1- en CB2-positieve tumorcellen als 0: negatieve kleuring- 0-4% van de tumorcellen positief; 1: 5-24% van de tumorcellen positief; 2: 25-49% van de tumorcellen positief; 3: 50-100% van de tumorcellen positief en de intensiteit als 0: negatieve kleuring, 1: milde kleuring; 2: intermediaire kleuring; 3: intense kleuring . Ten slotte werd de expressie van CB1 en CB2 geclassificeerd als laag, als de totale score 0 of 2 was en hoog en als de totale score ≥3 was. Ki-67 immunoreactiviteit werd geclassificeerd op basis van het percentage positief gekleurde folliculaire cellen boven de mediaan procentuele waarde in twee categorieën (onder en boven de gemiddelde waarde), zoals eerder gerapporteerd .

2.4. Statistische Analyse

Chi-kwadraat toetsen werden gebruikt om het verschil van CB1 en CB2 expressie te beoordelen tussen maligne en goedaardige schildklierlaesies, alsook tussen papillair carcinoom gevallen en hyperplastische nodules. Chi-kwadraat toetsen werden toegepast om de associaties tussen CB1 en CB2 expressie en klinisch-pathologische karakteristieken te beoordelen in de subgroep van patiënten met kwaadaardige schildklierlaesies. Een 2-tailed werd als statistisch significant beschouwd. Statistische analyses werden uitgevoerd met het softwarepakket SPSS voor Windows (versie 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

3. Resultaten

3.1. Klinische betekenis van CB1 expressie in menselijke kwaadaardige en goedaardige schildklierlaesies

CB1 positiviteit (IHC score > 0) werd vastgesteld in 52 (60%) van de 87 schildklierlaesies. Eenendertig (36%) van de 87 onderzochte gevallen vertoonden hoge CB1-immunoreactiviteit (IHC-score ≥ 3). Het subcellulaire patroon van CB1 distributie was overwegend cytoplasmatisch en soms membraans. Normale omliggende gebieden naast de tumor werden negatief bevonden voor CB1. Representatieve CB1 immunokleuringen voor hyperplastische nodule en papillair carcinoom zijn afgebeeld in Figuren 1(a) en 1(b), respectievelijk. CB1 immunoreactiviteit was significant verschillend tussen benigne en maligne schildklierlaesies (tabel 1, ). Hoge CB1 expressie werd significant vaker waargenomen in papillair carcinoom vergeleken met hyperplastische nodules (Tabel 1, ). CB1 expressie was niet geassocieerd met de leeftijd en het geslacht van de patiënten en met de proliferatieve capaciteit van de folliculaire cellen. In de subgroep van maligne schildklierletsels werd hoge CB1 expressie vastgesteld in 23 (52%) van de 44 gevallen. Er was geen verband tussen CB1 receptorexpressie en de grootte van de tumor, de aanwezigheid van capsulaire, vasculaire of lymfatische invasie, lymfekliermetastase en de proliferatie van folliculaire cellen (Tabel 2). CB1 receptorexpressie was niet geassocieerd met het risico op recidief geschat volgens het ATA stadiëringssysteem (gegevens niet aangetoond).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figuur 1

Representatieve CB1-immunokleuringen in: (a) hyperplastische nodule en (b) papillair carcinoom. Representatieve CB2 immunokleuringen in (c) hyperplastische nodule en (d) papillair carcinoom (originele vergroting ×200).

3.2. Clinical Significance of CB2 Expression in Human Malignant and Benign Thyroid Lesions

CB2 positivity (IHC score > 0) was noted in 61 (71%) van de 87 thyroid lesions. Tweeëndertig (37%) van de 87 onderzochte gevallen vertoonden hoge CB2-immunoreactiviteit (IHC-score ≥ 3). Het subcellulaire distributiepatroon was overwegend cytoplasmatisch en soms membraans. Normale omliggende gebieden grenzend aan de tumor werden negatief bevonden voor CB2. Representatieve CB2 immunokleuringen voor hyperplastische knobbeltjes en papillair carcinoom zijn afgebeeld in Figuren 1(c) en 1(d), respectievelijk. Hoge CB2 expressie werd significant vaker waargenomen in kwaadaardige schildklier laesies in vergelijking met goedaardige, alsmede in papillair carcinoom in vergelijking met hyperplastische nodules (tabel 1, en , resp.). In de subgroep van kwaadaardige schildklierletsels werd een hoge CB2-expressie vastgesteld in 24 (55%) van de 44 gevallen. Hoge CB2 expressie was significant geassocieerd met de aanwezigheid van lymfekliermetastase (Tabel 2, ). Hoge CB2 expressie werd ook geassocieerd met de aanwezigheid van capsulaire, lymfatische invasie en vasculaire invasie, maar op een niet-significant niveau (Tabel 2, , , en , resp.). Er werden geen associaties vastgesteld tussen CB2 expressie en de leeftijd en het geslacht van de patiënten, de grootte van de tumor en de proliferatiegraad van de folliculaire cellen (Tabel 2). Hoge CB2 receptorexpressie werd vaker waargenomen in kwaadaardige schildklierlaesies die een verhoogd risico op recidief vertonen volgens het ATA stadiëringssysteem, op een niet-significant niveau echter ().

4. Discussie

In de huidige studie was CB1 en CB2 eiwitexpressie verhoogd in kwaadaardige in vergelijking met goedaardige schildklierlaesies. We beschrijven ook voor de eerste keer een verband tussen CB2-eiwitexpressie en klinisch-pathologische parameters die cruciaal zijn voor het beheer en de prognose van patiënten. Meer bepaald was de verhoogde CB2 expressie significant geassocieerd met de aanwezigheid van lymfekliermetastasen en borderline met de aanwezigheid van vasculaire invasie, terwijl indicatieve maar niet-significante associaties met de aanwezigheid van capsulaire en lymfatische invasie en geschatte recidiefkans ook werden vastgesteld. Vergelijkbare resultaten voor CB1 receptor overexpressie werden verkregen voor kwaadaardige in vergelijking met goedaardige schildklierlaesies; niettemin werd een niet-significante associatie of correlatietrend tussen CB1 expressie en klinisch-pathologische parameters vastgesteld.

In overeenstemming met de huidige bevindingen werden CB receptoren geüpreguleerd in bepaalde tumor menselijke maligniteiten, waaronder orale plaveiselcelcarcinomen, pancreas-, hepatocellulaire en prostaatcarcinomen, terwijl ze niet tot expressie kwamen in normale weefsels van deze organen. Anderzijds werd de CB1-receptor gedownreguleerd in colorectaal carcinoom in tegenstelling tot aangrenzend normaal weefsel, wat wijst op de verschillende rollen van het ECS in diverse tumoren en op de meervoudige interacties tussen het ECS en de mechanismen die celgroei en -proliferatie controleren. Deze mechanismen kunnen directe inductie van de dood van getransformeerde cellen, celcyclusstilstand, en remming van tumorangiogenese en metastase omvatten. De antitumorale effecten van ECS zijn ook in talrijke studies aangetoond. Bij colorectale kanker waren endocannabinoïden en synthetische cannabinoïden in staat apoptose te induceren en de carcinogenese te remmen door mechanismen waarbij zowel CB-receptoren, TRPV1-kanalen als de PPARγ-pathway betrokken zijn. Vergelijkbare resultaten zijn bereikt in studies uitgevoerd op pancreas-, long- en borstkanker, cholangiocarcinoom en hepatocellulair carcinoom. Synergetische effecten van cannabinoïden met conventionele antitumorchemotherapie zijn ook gerapporteerd.

CB-receptor overexpressie in schildkliercarcinoom is onlangs gerapporteerd, in vitro . Meer ter zake, IL-12 stimulatie van anaplastisch schildkliercarcinoom cellijnen induceerde CB2-receptor overexpressie en leidde tot CB2-agonist gemedieerde apoptose en tumor regressie . Bovendien maakte CB2 upregulatie de tumorcellen gevoeliger voor behandeling met standaard chemotherapie. Een mogelijke verklaring voor dit fenomeen was de ceramide-afhankelijke activering van de mitochondriale intrinsieke route, die tot apoptose leidt, door de activering van de CB2-receptor. Een andere studie op schildkliercarcinoomcellijnen toonde aan dat 2-methyl-2′-F-anandamide (Met-F-AEA) de tumorgroei remde, geassocieerd met hoge CB1-receptorniveaus. De overvloedige CB1-receptorexpressie werd waargenomen in cellijnen die gevoeliger waren voor behandeling, en die vervolgens gevoeliger waren voor groeiremming. Dergelijke resultaten werden toegeschreven aan p53 activering, toename, en cycline A afname, leidend tot apoptose.

Naast de mogelijke therapeutische implicaties betreffende tumorigenese en ECS, kan detectie van CB-receptor overexpressie potentieel hebben als prognostische indicator. Upregulatie van beide CB receptoren in weefselmonsters van hepatocellulair carcinoom werd significant geassocieerd met een betere prognose en een langere ziektevrije overleving. Dergelijke bevindingen werden gecombineerd met de histopathologische tumorkenmerken, aangezien hoge CB-receptorniveaus werden waargenomen in gevallen met een goede differentiatie en beperkte betrokkenheid van het poortaandeel. Anderzijds werd CB2 immunoreactiviteit geassocieerd met een kortere ziektevrije overleving in plaveiselcelcarcinomen in hoofd en nek. De overexpressie van de CB1-receptor werd geassocieerd met een slechtere uitkomst voor patiënten in colorectaal, prostaat- en pancreascarcinoom. Met name verhoogde CB1 expressie in stadium IV colorectaal carcinoom patiënten was onafhankelijk gecorreleerd met slechte prognose. Verhoogde CB1 expressie werd ook geassocieerd met agressief prostaatadenocarcinoom met een hogere Gleason score, grotere tumorgrootte, verhoogde celproliferatie en metastase bij diagnose. Bovendien waren lage CB1 expressie of hoge FAAH/MAGL niveaus gecorreleerd met een langere overlevingsduur en een hogere pijnstatus. Gelijkaardige maar niet statistisch significante resultaten werden genoteerd voor CB2 receptor. Rekening houdend met de hierboven vermelde gegevens, lijken de momenteel beschikbare studies over CB receptor niveaus en hun associaties met prognose in verschillende tumoren tegenstrijdig en kunnen ze nauw samenhangen met de mate van ECS participatie in tumorigenese.

5. Conclusie

Enhanced CB1 en CB2 receptor immunohistochemische expressieniveaus waren gecorreleerd met schildkliermaligniteit. Bovendien waren verhoogde CB2 expressieniveaus geassocieerd met klinisch-pathologische kenmerken die belangrijk zijn voor het therapeutisch beheer van patiënten. Deze resultaten ondersteunen het bewijs dat CB receptoren en vooral CB2 receptor kunnen interfereren met moleculaire pathways die betrokken zijn in schildklier maligne transformatie en beschouwd kunnen worden als potentiële therapeutische doelwitten om tumorprogressie te onderdrukken. Grotere cohortstudies worden sterk aanbevolen om de klinische bruikbaarheid van CB-receptoren als potentiële prognostische markers in schildklierneoplasie te bevestigen en vast te stellen.

Conflict of Interests

Alle auteurs verifiëren dat zij geen financiering of steun hebben aanvaard van een organisatie die op enigerlei wijze financieel voordeel of nadeel zou kunnen ondervinden van de resultaten van deze studie. Alle auteurs verifiëren dat zij niet in dienst zijn geweest van een organisatie die op enigerlei wijze financieel voordeel of nadeel zou kunnen hebben van de resultaten van deze studie. Geen van de auteurs heeft andere belangenconflicten.

Bijdrage van de auteurs

Eleftheria Lakiotaki en Constantinos Giaginis hebben in gelijke mate bijgedragen tot de studie.