ChIP van het oude blok: Voorbij chromatine immunoprecipitatie

Een groot aantal technieken bouwt voort op een klassieke methode-chromatine immunoprecipitatie (ChIP)-om te beoordelen wat zich bindt aan DNA en waar. Technieken in opkomst verkleinen de omvang van monsters, ondervragen DNA-gebonden eiwitcomplexen, of beoordelen de betrokken nucleotiden nauwkeuriger. Al deze benaderingen zijn erop gericht om langdurige beperkingen van ChIP te overwinnen en de vragen die wetenschappers kunnen stellen over genregulatie, ontwikkeling en ziekte te verbreden.

Chromatine immunoprecipitatie, een van de meest gebruikte technieken in de moleculaire biologie, werd meer dan 30 jaar geleden uitgevonden – en sommige dingen zijn veranderd, terwijl andere hetzelfde zijn gebleven.

Het basisprotocol is nog steeds vergelijkbaar met een protocol dat in de jaren 1980 werd ontwikkeld, waarbij eiwitten aan DNA worden gekruist met formaldehyde en vervolgens het DNA wordt gefragmenteerd. Een DNA-interacterend eiwit wordt geïmmunoprecipiteerd met behulp van een antilichaam, de crosslinks ongedaan gemaakt met warmte, en het bijbehorende DNA geanalyseerd. Onderzoekers koppelden de techniek later aan deep sequencing en ontwikkelden de ChIP-seq techniek om eiwit-DNA interacties op genoomschaal te onderzoeken.

ChIP is gebruikt om te onderzoeken hoe transcriptiefactoren werken, hoe histonen genexpressie moduleren, en andere fundamentele vragen met implicaties voor biologische ontwikkeling en ziekte. In september wonnen C. David Allis en Michael Grunstein de prestigieuze Lasker-prijs voor hun werk aan histonen-onderzoek dat berustte op ChIP. En ChIP-seq is nu een hoeksteen van het ENCODE-project (ENCyclopedia Of DNA Elements), een poging om regulerende regio’s van het genoom in verschillende celtypes in kaart te brengen.

Chromatinebiologen ontwikkelen ook een reeks afgeleide of parallelle technologieën om verder te gaan dan wat ChIP en ChIP-seq bieden – om complexen van eiwitten te onderzoeken, om nauwkeuriger te bepalen aan welke nucleotiden een factor zich precies bindt, om naar kleine groepen cellen te kijken, en om, voorzichtig, te beginnen met het beoordelen van eiwit-DNA-interacties op het niveau van één cel.

Al deze technieken zijn bedoeld om dingen te doen die ChIP-seq alleen niet kan, of slechts traag doet. En ze hebben allemaal hetzelfde basisdoel: om erachter te komen welke moleculen zijn geassocieerd met DNA en waar.

“We begrijpen echt niet de fundamentele principes waarmee regulerende functionele sequenties in ons genoom bepalen waar en wanneer genen aanslaan,” zegt Bradley Bernstein, directeur van het Broad Institute’s Epigenomics Program in Cambridge, Massachusetts. Hij voegt eraan toe dat ChIP “in veel opzichten beperkt is. En dus zijn er deze inspanningen om te proberen nieuwe benaderingen te innoveren of de technologie op nieuwe manieren aan te passen.”

“We moeten komen met precieze, deterministische manieren om direct single-molecule interacties systematisch in enkele cellen te evalueren.”

Het laten werken

“Een duistere kunst noemen is te veel van het goede,” zegt Nir Friedman, een hoogleraar informatica en biologie aan de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem, Israël. Maar ondanks dat het een veelgebruikte techniek is, “hebben maar weinig mensen geduld genoeg om hun experimenten te kalibreren,” zegt hij.

ChIP-seq-experimenten genereren veel ruis, merkt Friedman op. Formaldehyde kan niet-betrokken moleculen crosslinken, antilichamen kunnen niet-doelwit eiwitten naar beneden trekken, en sonicatie – de meest gebruikelijke manier om DNA op te breken – heeft de neiging om DNA dat in een open conformatie is op te breken. Zegt Friedman: “Het kan zijn dat meer dan de helft van wat je uiteindelijk sequentiëert of bekijkt, niet-specifieke binding is.”

ENCODE publiceert richtlijnen voor het beoordelen van de kwaliteit van antilichamen en het uitfilteren van zinloze gegevens, merkt Friedman op. Het project biedt ook toegang tot recente computationele hulpmiddelen die bijvoorbeeld worden gebruikt om gegevens te normaliseren ten opzichte van controles en om “pieken” of regio’s van mogelijke DNA-binding te identificeren.

Het kiezen van het juiste antilichaam, in het bijzonder, kan een uitdaging zijn, merkt Michael-Christopher Keogh op, chief scientific officer bij EpiCypher, een epigenomics-bedrijf in Research Triangle Park, Durham, North Carolina. Keogh was betrokken bij een recente studie die aantoont dat veel antilichamen die populair zijn voor histononderzoek slecht presteren bij ChIP, bijvoorbeeld door binding aan off-target epitopen. De studie stelt ook validatiestappen voor die verder gaan dan de ENCODE-richtlijnen.

Sommige onderzoekers omzeilen het antilichamenprobleem door een epitoopmarkering op hun doelwit aan te brengen, zoals bij CETCh-seq (CRISPR epitope tagging ChIP-seq). Een techniek die al lang bestaat, DamID (DNA adenine methyltransferase identification), omvat de engineering van factoren om naburig DNA te taggen met moleculaire markeringen.

Andere onderzoekers zijn nog steeds bezig met het verbeteren van de basis ChIP-techniek, zoals Alon Goren’s groep aan de University of California San Diego’s Department of Medicine, die volledig geautomatiseerde ChIP-seq heeft. Goren zegt dat de optimale antilichaamconcentratie aanzienlijk kan variëren naar gelang van het antilichaam en het celtype, en dat sommige stappen, zoals omgekeerde crosslinking, overbodig zijn. Het Goren Lab heeft ook aangetoond dat monoklonale antilichamen het voordeel hebben ten opzichte van polyklonale antilichamen.

Maar zelfs wanneer volledig geoptimaliseerd, is ChIP-seq nog steeds fundamenteel beperkt. Zo zijn er over het algemeen 100.000 of meer cellen nodig om transcriptiefactoren te beoordelen en 10.000 of meer om histon-eiwitten te beoordelen, zegt Goren. En in de meeste gevallen is de methode gericht op het bekijken van één eiwit, één antilichaam per keer.

Zegt Goren: “Zodra we in staat zijn om de blik te verschuiven van het denken over eiwitten naar het denken over complexen, zullen we een veel beter begrip krijgen van hoe de biologie werkt en wat er gebeurt bij ziekte.”

Het krijgen van grip op eiwitcomplexen

Een benadering om complexen te onderzoeken is het combineren van ChIP-seq met massaspectrometrie (MS), met behulp van methoden zoals RIME (Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins) en ChIP-MS.

Een nadeel van deze methoden is echter dat eiwitten die niet geassocieerd zijn met DNA ook naar beneden kunnen worden getrokken door immunoprecipitatie, zegt David Steger, een moleculair bioloog aan de Universiteit van Pennsylvania, in Philadelphia. In plaats daarvan, zegt Steger, “Wat iedereen probeert te ontwikkelen is locus-specifieke proteomica op een bepaalde enhancer.”

Een opkomende techniek om chromatine-gebonden complexen te beoordelen is ChIP-SICAP (selectieve isolatie van chromatine-geassocieerde eiwitten), ontwikkeld door Jeroen Krijgsvelds team van het Duitse Cancer Research Center in Heidelberg, Duitsland, en zijn collega’s. De techniek omvat het taggen van antilichaam-gebonden DNA met biotine, dat vervolgens wordt neergehaald met biotine-bindende streptavidine korrels voor mass spec.

Steger past ChIP-SICAP toe om eiwitten te onderzoeken die zijn gebonden aan versterkers die de overgang van mesenchymale stamcellen naar adipocyten aansturen. Steger zegt: “Wat we proberen te doen is een enhancer proteoom te identificeren.”

Andere benaderingen maken gebruik van het gen-editing systeem met Cas9, dat gids-RNA’s herkent die gericht zijn op specifieke DNA-sequenties. Onderzoekers hebben Cas9 gelabeld met biotine of een enzym dat de biotine-labeling van nabijgelegen eiwitten bevordert, die worden geanalyseerd door MS. Deze aanpak is ook gebruikt om interacties tussen ver van elkaar verwijderde genomische elementen aan het licht te brengen. Dergelijke methoden kunnen mogelijk het repertoire uitbreiden van ChIP-seq-gerelateerde methoden die de 3D-architectuur van het genoom kunnen beoordelen, zoals Hi-C, ChIA-PET (Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag sequencing), en HiChIP, en meer recente methoden zoals SPRITE (Split-Pool Recognition of Interactions by Tag Extension).

Deze opkomende methoden om DNA-gebonden complexen te beoordelen beloven biologen een scherper beeld te geven van genregulatie. Maar wanneer ze worden gebruikt voor MS, hebben ze te maken met de beperking dat MS niet gemakkelijk eiwitten met een lage overvloed detecteert, merkt Steger op. Bovendien zijn niet alle nieuwere technieken toegankelijk voor de niet-expert.

Er zijn bedrijven die diensten aanbieden voor het uitbesteden van meer gevestigde technieken, zoals RIME of ChIP-seq. Bedrijven die ChiP-seq en aanverwante diensten aanbieden zijn onder meer Active Motif, in Carlsbad, Californië; Diagenode in Luik, België en Denville, New Jersey; en het in Peking gevestigde Novogene. Deze en andere bedrijven bieden ook ChIP-seq kits en componenten aan, hoewel veel laboratoria hun eigen reagentia genereren. Keogh merkt ook op dat in-house onderzoek een grotere controle over optimalisatiestappen kan betekenen.

Zorg voor experimentele parameters tijdens ChIP-experimenten kan zelf de kwaliteit van gegevens verhogen, zegt Cigall Kadoch, wiens groep verschillende grote macromoleculaire eiwitcomplexen bestudeert aan het Dana-Farber Cancer Institute en de Harvard Medical School in Boston, Massachusetts.

Kadoch is zorgvuldig om de concentratie formaldehyde te optimaliseren die wordt gebruikt om eiwitten met elkaar en DNA te crosslinken, voor elk antilichaam en celtype. Bij de keuze van antilichamen let zij erop of de epitoop naar verwachting toegankelijk is op het oppervlak en dus geschikt is voor immunoprecipitatie. En om de DNA-voetafdruk van een volledig geassembleerd complex te zien, adviseert zij een antilichaam te kiezen tegen een eiwit dat laat in het assemblageproces wordt toegevoegd. “Dit zijn de dingen die een project maken of breken,” zegt Kadoch.

Zeroing in on factor binding

Een andere techniek die Steger gebruikt is ChIP-exo (ChIP exonuclease). Hij gebruikt het om te identificeren – op basis-paar resolutie – waar verschillende factoren het genoom binden.

Deze techniek begint met DNA-fragmentatie door sonicatie. Een exonuclease kauwt het DNA op (in de 5′-3′ richting) tot aan de rand van waar het DNA door formaldehyde aan het gebonden eiwit is gekoppeld. Deze aanpak resulteert in een scherpe DNA-“voetafdruk” voor gebonden factoren, die preciezer kan zijn dan de afgeleide motieven die computationeel worden gegenereerd met behulp van ChIP-seq.

“We beginnen altijd met ChIP-seq, en als onze vragen zich ontwikkelen, gaan we over op ChIP-exo,” zegt Steger, die de techniek heeft gebruikt om de binding van de glucocorticoïdreceptor aan DNA te beoordelen. De receptor bindt als een dimeer aan twee naast elkaar liggende, korte DNA-sequenties. Steger was in staat de binding van één monomeer op te lossen, wat hem met ChIP-seq niet lukte.

Het team van Frank Pugh, hoogleraar biochemie en moleculaire biologie aan de Penn State University in University Park, Pennsylvania, heeft onlangs zijn ChIP-exo-methode vereenvoudigd en aangepast aan het algemeen gebruikte Illumina-sequencingplatform. Ook Julia Zeitlinger, geassocieerd onderzoeker aan het Stowers Institute for Medical Research in Kansas City, Missouri, en haar collega’s hebben een verwante techniek gepubliceerd, ChIP-nexus. Beide ontwikkelingen zijn “veelbelovend”, zegt Michael Snyder, voorzitter van de genetica en directeur van het Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine aan de Stanford University, in Californië.

Ga kleiner en dieper

Onderzoekers zijn in staat geweest om het aantal cellen dat nodig is voor ChIP-seq af te schaven door experimentele parameters aan te passen, zoals het gebruik van een antilichaam van hoge kwaliteit, zegt Friedman.

Sommige technieken, waaronder een die Friedman heeft ontwikkeld, maken gebruik van sequencing-adapters met streepjescodes, waardoor de monstergrootte kan worden verkleind. En een nieuwe techniek genaamd “ChIPmentation” vermindert de stappen die betrokken zijn bij het maken van sequencing-bibliotheken.

Een methode die zijn weg vindt naar nieuwe laboratoria is CUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease), ontwikkeld door Steve Henikoff en zijn collega’s van het Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle, Washington. Bij deze methode worden verknoping door formaldehyde en DNA-scheuring met sonicatie achterwege gelaten. In plaats daarvan wordt een antilichaam tegen het doelwit gebonden aan micrococcal nuclease (MNase), dat door calcium wordt geactiveerd om het DNA aan weerszijden van het doelwit te klieven. De resulterende DNA-fragmenten worden gesequenced.

“Je krijgt een grote signaal-ruis reductie” in vergelijking met ChIP-seq, zegt John Stamatoyannopoulos, directeur van het Altius Instituut voor Biomedische Wetenschappen in Seattle. Dat is gedeeltelijk te danken aan het schone snijden van DNA door de nuclease, met lage niveaus van off-site snijden. Als gevolg daarvan vereist CUT&RUN doorgaans minder DNA-sequencingleests dan ChIPseq – waardoor de kosten lager zijn – en kan het worden toegepast op veel lagere celaantallen. Henikoffs team paste de techniek onlangs toe op 1.000 cellen voor een transcriptiefactor en op 100 cellen voor een histonmodificatie. Stamatoyannopoulos zegt dat de methode ChIP-seq in zijn laboratoria grotendeels heeft verdrongen.

CUT&RUN heeft ook voordelen die verder gaan dan lage celaantallen. Stuart Orkin, een moleculair bioloog en professor aan de Harvard University, prijst de techniek aan voor zijn “in wezen nucleotide-niveau” resolutie. Met kleine aanpassingen aan de computationele hulpmiddelen was zijn groep in staat om de dicht bij elkaar liggende bindingsplaatsen van een transcriptiefactor die betrokken is bij de controle van de expressie van foetale hemoglobine, te onderscheiden. Voordat hij dit resultaat bereikte, was hij niet in staat de transcriptiefactor met conventionele ChIP te immunoprecipiteren, mogelijk omdat formaldehyde crosslinking de epitopen verborg. CUT&RUN “werkte meteen,” zegt hij.

Henikoff’s lab heeft de techniek aangepast om lange-afstand, 3D DNA interacties te beoordelen, en om immunoprecipitatie uit te voeren op de uitgesplitste fragmenten met behulp van een tweede antilichaam. De groep ondervroeg twee moleculaire kenmerken op hetzelfde eiwitcomplex – een benadering die zou kunnen helpen bij het oplossen van vragen zoals welke combinaties van histon-markeringen geassocieerd zijn met verschillende genstatussen.

Werken op het niveau van een enkele cel

Voor veel moleculaire biologen, waaronder chromatine-onderzoekers, is de enkele cel de laatste grens.

“We moeten met precieze, deterministische manieren komen om interacties tussen enkelvoudige moleculen in enkelvoudige cellen direct en systematisch te evalueren,” zegt Bernstein. “Dat is een doel voor de lange termijn. Single-cell data zouden mogelijk DNA-bindende factoren kunnen traceren als cellen de stam-celtoestand verlaten tijdens de ontwikkeling, of in tumoren met hoge niveaus van cellulaire heterogeniteit.

Er zijn verschillende benaderingen die dichter bij dit doel komen. Maar “veel van de eencellige methoden hebben een beperkte gevoeligheid,” zegt Christopher Benner, een genoombioloog aan de Universiteit van Californië, San Diego. Bernstein en zijn collega’s hebben bijvoorbeeld ChIPseq-gegevens van één cel gegenereerd met behulp van een microfluïdisch systeem en barcoding. Van elke cel ving de techniek tussen 500-10.000 unieke “reads”, die een DNA-bindende gebeurtenis vertegenwoordigen, in tegenstelling tot de miljoenen reads die werden vastgelegd met populaties van cellen.

Verschillende methoden kunnen ook gegevens opleveren over de actieve regio’s van het genoom. ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) maakt gebruik van een hyperactieve transposase die integreert in het genoom in open chromatine regio’s en introduceert sequencing adaptors. ATAC-seq kan worden aangepast aan enkele cellen en de resulterende sequentiegegevens ondervraagd met een verscheidenheid van computationele benaderingen. Deze benaderingen kunnen bijvoorbeeld promotorsequenties identificeren – of patronen vaststellen in experimenten waarbij tegelijkertijd DNA-controle-elementen worden uitgeklopt of RNA-expressie wordt beoordeeld.

ATAC-seq lijdt aan nadelen, zoals onvolledige integratie in toegankelijke regio’s, merkt Snyder op. Maar de techniek kan krachtig zijn: het kan worden ingezet om fluoroforen in te voegen en af te beelden, wat resulteert in beeldvormende gegevens over 3D genomische organisatie voorafgaand aan sequencing, merkt Snyder op.

Snyder wijst op beeldvormend werk in laboratoria zoals dat van Alistair Boettiger in Stanford, die manieren ontwikkelt om tegelijkertijd genetische elementen en ontluikende RNA-transcripten af te beelden met superresolutiebeeldvorming, om te beoordelen welke elementen genexpressie bevorderen of afremmen. “Beeldvorming is de toekomst,” voegt Stamatoyannopoulos eraan toe. Andere onderzoekers merken op dat naarmate “derde-generatie” nanopore-sequencing verbetert, ChIP-achtige methoden zullen worden ontwikkeld om erop aan te sluiten.

“We hebben misschien geheel orthogonale manieren nodig om dit te doen,” zegt Bern-stein over chromatineanalyse van eencelligen. Dat doel zal waarschijnlijk met succes worden bereikt op het einde, zegt hij, met “technologieën die een radicale afwijking zijn van wat we nu gebruiken.”

Zend uw nieuwe product persbericht/beschrijving of productliteratuur informatie naar [email protected]. Bezoek Science New Products voor meer informatie.

Nieuw aangeboden instrumentatie, apparatuur en laboratoriummaterialen die van belang zijn voor onderzoekers in alle disciplines in academische, industriële en overheidsorganisaties worden in deze ruimte uitgelicht. De nadruk wordt gelegd op doel, hoofdkenmerken, en beschikbaarheid van producten en materialen. Goedkeuring door Science of AAAS van enige genoemde producten of materialen wordt niet geïmpliceerd. Aanvullende informatie kan worden verkregen bij de fabrikant of leverancier.