Chemische derivatisering in bioanalyse

Toepassingen

Chemische derivatisering heeft zich reeds lang bewezen als analysetechniek in de bioanalyse om problemen in verband met een lage ionisatie-efficiëntie, instabiliteit van verbindingen, slechte selectiviteit of onaanvaardbare chromatografische prestaties (slechte retentie, slechte piekvorm en carry-overproblemen) en zelfs slechte vluchtigheid voor GC-scheiding te verhelpen. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel op vele gebieden van de chemie, met inbegrip van de medische, forensische, voedingswetenschappen, dopingcontrole en milieudisciplines. Het doel van chemische derivatisering is de structuur van de analyt (een nucleofiel of een elektrofiel) te wijzigen met behulp van een chemisch reagens (een elektrofiel of een nucleofiel, afhankelijk van de aard van de analyt), waardoor een nieuwe verbinding (het derivaat van de reactie) met verbeterde chemische en fysische eigenschappen voor analyse wordt gevormd. De reactieomstandigheden (hoeveelheid reagens, reactietijd en -temperatuur, enz.) worden geoptimaliseerd ten behoeve van de vorming van het gewenste derivaat met een zo hoog mogelijk reactie-rendement. Er kunnen extra monsteropruimingsprocedures worden ontwikkeld om ongewenste bijprodukten en overtollige reagentia te elimineren, zodat de analyten bij de analyse zo weinig mogelijk worden beïnvloed.

Met chemische derivatisering wordt analyse van het onmogelijke mogelijk. In de literatuur zijn hiervan vele voorbeelden te vinden, die van invloed zijn op GC, LC-MS/MS en NMR-detectie. Het meest opmerkelijk is de chromatografische scheiding van enantiomeren door middel van chirale derivatisering met behulp van specifieke oplossende reagentia zonder het gebruik van gespecialiseerde chirale kolommen en scheidingscondities.

Overwegingen

De keuze van het juiste chemische reagens is essentieel voor een succesvolle derivatisering en is afhankelijk van de specifieke toepassing. In het algemeen, als de doelanalyt een nucleofiel is (verbinding met een overmaat aan elektronen), wordt een elektrofiel (verbindingen met een algemeen elektronentekort) als reagens geselecteerd, en omgekeerd. De reagentia moeten selectief zijn (gericht zijn op één specifieke plaats van het molecuul), zodat derivatisering op meerdere plaatsen in het doelmolecuul, metabolieten of endogene componenten wordt vermeden. Zo moet bijvoorbeeld voor een molecuul dat zowel hydroxyl- als aminofunctionele groepen bevat, het gebruik van zuurchloriden of anhydriden als derivatisatiereagens worden vermeden, aangezien deze beide functionele groepen zullen derivatiseren. Daarentegen is het gebruik van dansylchloride als derivatiseringsreagens geschikt voor amino- en fenolgroepen, aangezien dit niet reageert met alifatische alcoholen. Andere vereisten waarmee rekening moet worden gehouden bij de keuze van het reagens zijn beschikbaarheid (in de handel), zuiverheid en kosten. In het algemeen zijn de kosten van de reagentia minimaal en vormen daarom geen belemmering voor het gebruik.

Met gebruikmaking van geoptimaliseerde condities zijn chemische derivatiseringsprocedures in het algemeen robuust genoeg om te worden toegepast voor farmaceutische bioanalyse, en zijn zij in staat aan de verwachtingen op het gebied van de regelgeving te voldoen. Dit wordt gewoonlijk aangetoond tijdens een rigoureus validatieproces waarbij verschillende parameters, met inbegrip van maar niet beperkt tot, nauwkeurigheid, precisie, selectiviteit, matrixeffect, enz. De keuze van de interne standaard is essentieel om te corrigeren voor mogelijk verlies van analyt tijdens de verschillende stappen van monsterbehandeling en bioanalyse; aldus wordt de robuustheid van de assay gewaarborgd. Indien mogelijk moet een deuterium- of 13C-stabiele interne standaard worden gebruikt, anders kan een analoog met een vergelijkbare reactiviteit, terugvinding en chromatografische eigenschappen worden vervangen. Ook moeten waar mogelijk de metabolische routes van de te analyseren stof in aanmerking worden genomen en geëvalueerd; omzetting van metabolieten in het moedermolecuul moet tijdens de derivatiseringsprocedure worden vermeden, aangezien deze processen vaak gepaard gaan met agressieve omstandigheden (pH, warmte, lange incubatietijden, enz.). Helaas kan dit worden gecompliceerd door het ontbreken van referentiestandaarden voor de metabolieten en het ontbreken van metabolische informatie vroeg in de levenscyclus van de geneesmiddelenontwikkeling als gevolg van differentiële of versnelde ontwikkelingsstrategieën.

Chemische derivatisering als kunstvorm

Het gebruik van chemische derivatisering is de laatste jaren afgenomen naarmate nieuwe scheidingstechnologieën zich hebben ontwikkeld en meer gemeengoed zijn geworden. De evolutie van superkritische vloeistofchromatografie (SFC), bijvoorbeeld, heeft een nieuwe weg geopend voor chirale stereoisomerische analyse; daardoor is de noodzaak van chirale derivatisering in bepaalde gevallen verminderd. Gevoeligere generaties triple quadrupole massaspectrometrische instrumenten met nieuwe of verbeterde ionisatietechnologieën brengen de detectielimieten op een laag picogram-niveau, waardoor de vraag naar chemische derivatisering ter verbetering van de gevoeligheid van de analyse (door verbeterde ionisatie of selectiviteit) is afgenomen. Andere technologieën, zoals UHPLC; micro-/nano-LC (voor een betere ionisatie-efficiëntie); TOF-instrumenten met ion-mobiliteitscapaciteit (elektronische scheiding in plaats van chemische/fysische), hebben ook bijgedragen tot de afname van chemische derivatisering in het bioanalytisch laboratorium. Dit gezegd zijnde, wordt de techniek echter nog steeds toegepast voor zeer complexe scheidingen waarbij bovengenoemde technologieën niet voldoende effect kunnen sorteren. Soms heeft de koppeling van chemische derivatisering met een van deze technologieën een versterkt/aanvullend effect. Met name is gebleken dat de combinatie van SFC met chirale derivatisering superieur is voor chirale scheiding in vergelijking met die SFC-analyse (gegevens niet aangetoond).

Door deze achteruitgang van de techniek en de complexiteit ervan in vergelijking met andere analytische technieken, is chemische derivatisering uitgegroeid tot een gespecialiseerde “kunstvorm” in het laboratorium, waarvoor gespecialiseerde vaardigheden in combinatie met een sterke scheikundige vaardigheid vereist zijn. Als gevolg daarvan slagen minder wetenschappers in DMPK-omgevingen erin de techniek onder de knie te krijgen en bedreven te worden in de toepassing ervan. De vraag is dan hoe deze vaardigheden kunnen worden behouden en aan de toekomstige generaties van analytische wetenschappers kunnen worden doorgegeven. Speciale nummers zoals deze, overzichtsartikelen, boekhoofdstukken, begeleiding met experimentele protocollen zullen hopelijk het gebruik van chemische derivatisering als groot analytisch hulpmiddel vergemakkelijken en bevorderen.

Outline

Dit themanummer behandelt de vooruitgang in bestaande derivatiseringstechnieken die in bioanalytisch onderzoek worden gebruikt, alsook innovatieve nieuwe methoden en benaderingen (bv, combinatie van derivatisering met microflow LC-MS en het idee van nieuwe chemische tagging technieken door Niwa et al. ).

Het nummer beoogt aspecten te behandelen die verband houden met:

• Derivatisatiemethoden in LC-MS bioanalyse (inclusief HPLC);

• Peptidederivatisering voor analyse van proteïne therapeutica;

• Chirale derivatisatiereagentia toegepast op biologische monsters (zie Vashistha et al. );

• Derivatisering voor de analyse van endogene verbindingen (zie “Beyond Classical Derivatization: Analyt ‘derivatives’ in the bioanalysis of endogenous and exogenous compounds’ van Barnaby et al. , of ‘Derivatization of steroids in biological samples for GC-MS and LC-MS analyses’ van Marcos et al. );

• Derivatization procedures in human doping control (zie interessante review van Athanasiadou et al. ).

Hoewel chemische derivatisering inderdaad slechts een extra instrument is in de bioanalytische gereedschapskist, is het een “must have” voor een DMPK-laboratorium en een instrument dat van invloed zal blijven op de aanpak van vele bioanalytische uitdagingen.

Daarom, als je niet van je analyt, verander het (met chemische derivatisering dat is)!