Caco-2 Permeability Assay

Vragen en antwoorden over Caco-2 permeabiliteit

Gelieve een overzicht te geven van Cyprotex’s Caco-2 Permeability assay.

Caco-2-cellen worden veel gebruikt als in vitro-model voor het voorspellen van de absorptie van geneesmiddelen bij de mens. De Caco-2 cellijn is afgeleid van een humaan colorectaal carcinoom, en wanneer gekweekt, differentiëren de cellen spontaan in monolayers van gepolariseerde enterocyten.

De cellen worden gezaaid op multiwell-insert platen en vormen een confluente monolayer gedurende 20 dagen voorafgaand aan het experiment. Op dag 20 wordt de testverbinding toegevoegd aan de apicale zijde van het membraan en wordt de flux van de verbinding over de monolayer gedurende een periode van 2 uur gevolgd. Om de efflux van het geneesmiddel te bestuderen, moet ook het transport van de verbinding van het basolaterale compartiment naar het apicale compartiment worden onderzocht.

De permeabiliteitscoëfficiënt (Papp) wordt berekend met de volgende vergelijking:

Waarbij dQ/dt de permeatiesnelheid van het geneesmiddel over de cellen is, C0 de donorconcentratie op het tijdstip nul en A het oppervlak van de celmonolaag.

Hoe interpreteer ik de gegevens van de Caco-2 permeabiliteitsbepaling?

Er zijn verschillende manieren waarop de gegevens van de Caco-2 permeabiliteitsbepaling kunnen worden gebruikt. Ten eerste kunnen de verbindingen worden gerangschikt aan de hand van hun Papp-waarden. Twee referentieverbindingen, atenolol (passief paracellulair transport) en propranolol (passief transcellulair transport) worden gescreend naast de testverbindingen. Van atenolol en propranolol is bekend dat zij bij de mens respectievelijk 50% en 90% absorberen2,3 en zij kunnen worden gebruikt als markers voor de rangschikking van testverbindingen. Ten tweede kunnen de gegevens in combinatie met andere in vitro-parameters worden gebruikt om de orale farmacokinetiek van een verbinding in vivo te voorspellen met behulp van de simulatiesoftware Cloe PK. Ten derde kunnen de Caco-2-gegevens worden gebruikt om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière (BBB) te voorspellen (figuur 3).

Figuur 3
Correlatie tussen van Caco-2 afgeleide Pactive ((PappB-A – PappA-B)/2) en in situ BBB-permeatiesnelheid, logPS (permeabiliteit-oppervlakproduct). Geneesmiddelen waarvan bekend is dat ze de BBB passeren (cafeïne, imipramine, progesteron) hebben een logPS >-2,0 (groen gearceerd gebied), terwijl geneesmiddelen waarvan bekend is dat ze de BBB niet passeren (aldosteron, hydrocortison, cimetidine) een logPS ≤-3,5 hebben (roze gearceerd gebied).

Een regressielijn wordt getoond die een duidelijke correlatie laat zien tussen Pactive en logPS voor verbindingen die niet onderhevig zijn aan significante niveaus van efflux-activiteit in de Caco-2-cellen, d.w.z, voor verbindingen met een Pactive van < 5 × 10 -6 cm/s. Met behulp van deze correlatie kan Cyprotex’s Caco-2 assay worden gebruikt om BBB-potentieel te evalueren voor verbindingen met een Pactive < 5 × 10 -6 cm/s.

Wat is de relatie tussen Caco-2 permeabiliteit en menselijke intestinale absorptie?

De relatie tussen Caco-2 permeabiliteit (met behulp van pH7,4 HBSS buffers in zowel de apicale en basolaterale compartimenten) en menselijke intestinale absorptie wordt weergegeven in figuur 4. Deze correlatie is typerend voor die welke in de literatuur voor deze twee parameters is waargenomen4. Het is belangrijk op te merken dat deze grafiek wordt beïnvloed door de nauwkeurigheid van de intestinale absorptiegegevens. De in deze grafiek gebruikte darmabsorptiewaarden zijn afkomstig van Zhao et al. 20012. In dit document is de intestinale absorptie bij de mens ontleend aan verschillende bronnen en varieert de kwaliteit aanzienlijk. Van verscheidene verbindingen is ook bekend dat zij een dosisafhankelijke absorptie vertonen (aangegeven door foutbalkjes in de grafiek).

Figuur 4
Relatie tussen Caco-2 permeabiliteit en % menselijke darmabsorptie.

Wat zijn de verschillen tussen de PAMPA- en de Caco-2-permeabiliteitsbepaling?

De Caco-2-permeabiliteitsbepaling wordt representatiever geacht voor de menselijke absorptie in vivo dan de PAMPA (parallel artificial membrane permeability assay). PAMPA geeft alleen een maat voor de passieve diffusie, terwijl het Caco-2-model een betere voorspelling geeft van de absorptie door de mens van verbindingen die een actieve opname of uitscheiding vertonen of via de paracellulaire weg door het membraan gaan. De informatie van beide assays in combinatie gebruikt kan waardevol zijn bij het identificeren van de hoofdoorzaak voor slechte absorptie.

Hoe meet ik drug efflux?

Een bi-directionele Caco-2 permeabiliteitsassay wordt uitgevoerd waarbij het transport van de verbinding wordt gemeten in de apicale naar basolaterale richting en de basolaterale naar apicale richting. Het resultaat wordt meestal gerapporteerd als een effluxratio, d.w.z. Papp(B-A)/Papp(A-B). Als de effluxratio groter is dan twee, wijst dat op een efflux van het geneesmiddel. Talinolol, een bekend P-gp-substraat, wordt gescreend als controleverbinding om te bevestigen dat de cellen functionele effluxtransporteiwitten tot expressie brengen.

Hoe weet u of de cellen een confluente monolaag hebben gevormd?

Transepitheliale elektrische weerstand (TEER) meting wordt gebruikt om tight-junction-vorming tussen cellen te bepalen. Bovendien wordt lucifer geel, een membraanintegriteitsmarker, samen met de testverbinding aan het begin van het experiment geïncubeerd. Als de Papp van lucifergeel in één well groter is dan 1,0 × 10-6 cm/s, maar het afgeleide Papp-resultaat voor de test- of controleverbinding in die well kwalitatief vergelijkbaar is met dat in de resterende replicatiewell(s) (binnen de drempelwaarde voor lucifergeel), kan de celmonolayer op basis van het wetenschappelijke oordeel van de verantwoordelijke wetenschapper als aanvaardbaar worden beschouwd. Als dit niet het geval is, wordt het resultaat van de aangetaste monolaag uitgesloten en wordt een n=1 resultaat gerapporteerd, of kan de verbinding opnieuw worden getest. Als beide replicaten aangetast zijn, wordt de verbinding opnieuw gescreend. Als beide lucifergele Papp-waarden voor dezelfde verbinding bij twee afzonderlijke gelegenheden mislukken, wordt aangenomen dat de verbinding ofwel cytotoxische effecten tegen de Caco-2-cellen ofwel inherente fluorescentie vertoont.

Hoe en waarom wordt het % terugvinding berekend?

Het % terugvinding kan nuttig zijn bij de interpretatie van de Caco-2-gegevens. Als de terugvinding zeer laag is, kan dit wijzen op problemen met de slechte oplosbaarheid, binding van de verbinding aan de plaat, metabolisme door de Caco-2-cellen of accumulatie van de verbinding in de celmonolaag.