A Universal Heparin Antidote with Negligible Effect on Fibrin(ogen) and Plasma Coagulation

Achtergrond en Doel

Anticoagulantia spelen een centrale rol bij de behandeling van trombo-embolische aandoeningen. Bloedingen bij chirurgische patiënten die anticoagulantia toegediend krijgen, vormen een groot probleem. Antidota worden toegediend om de antistolling tegen te gaan en de normale hemostase te herstellen. Tot op heden is protaminesulfaat (PS), een kationisch polypeptide, het enige klinisch goedgekeurde antidotum voor ongefractioneerde heparine. PS heeft toxische bijwerkingen en beperkingen. Het onvermogen van PS om laagmoleculaire heparines en fondaparinux volledig om te keren, is te wijten aan zijn lage bindingsaffiniteit met deze geneesmiddelen. PS interageert echter met stollingseiwitten zoals fibrinogeen om aggregaten te vormen, wat leidt tot cardiovasculaire bijwerkingen. Onlangs ontwikkelden wij een synthetisch universeel heparine reversal agent (UHRA) met hoge bindingsaffiniteit voor heparines. In vivo studies toonden aan dat UHRA de activiteit van alle klinisch beschikbare parenterale anticoagulantia volledig omkeert en niet toxisch is. Deze studie heeft tot doel de niet-toxische aard van UHRA aan te tonen door de invloed ervan op fibrinogeen, fibrinestolselarchitectuur, plasmaklontering en stolsellyse te beoordelen.

Methodes

UHRA werd ontwikkeld door tertiaire amine-gebaseerde heparine-bindende groepen op een dendritisch hypervertakt polyglycerol scaffold op te nemen en het af te dekken met methoxy polyethyleenglycolketens. Om de invloed van UHRA op het stollingssysteem te begrijpen, werden rekalcificatie en door weefselfactor (TF) geïnitieerde turbidimetrische plasma-stollingstesten uitgevoerd. De interactie van UHRA op fibrinogeen werd onderzocht door fibrinogeen aggregatie assay, fibrine polymerisatie assay en door spectroscopische analyse (fluorescentie en circulair dichroïsme (CD)). De invloed van UHRA op de architectuur van de fibrinestolsel werd geëvalueerd met behulp van scanning elektronen microscopie (SEM).De neutralisatie van anticoagulantia (heparines) door UHRA werd bestudeerd met behulp van fluorogene trombine generatie assay (TGA) in menselijk bloedplaatjes-rijk plasma (PRP). De lysis van TF-geïnduceerde plasmaklonten met UHRA of PS blootgesteld aan exogene weefselplasminogeenactivator (t-PA) werd bestudeerd door middel van een turbidimetrische assay.

Resultaten en discussie

Resultaten van de plasma-stollingstests toonden aan dat UHRA de stollingsparameters niet veranderde in vergelijking met PS (TF geïnitieerde vertragingstijd en maximale absorptie, controle vs UHRA 200 mcg/mL, p=0.21 en 0,16, respectievelijk; vertragingstijd en maximale absorptie bij recalcificatie, controle vs UHRA 200 mcg/mL, p=0,08 en 0,13, respectievelijk), wat suggereert dat UHRA bij de bestudeerde concentratie geen effect heeft op het stollingssysteem (figuur 1). In tegenstelling tot protamine werden de fibrinogeenaggregatie en de fibrinepolymerisatietest niet beïnvloed door UHRA over een breed concentratiebereik van 0,05mg/mL tot 1mg/mL. Samen met tryptofaan fluorescentie quenching metingen (figuur 2) en fibrinogeen secundaire structuur metingen bevestigt dat UHRA niet interageert met fibrinogeen. De resultaten zijn heel anders dan die van PS en andere synthetische kationische polymeren die met fibrinogeen aggregatie en conformatieveranderingen uitlokken. Fibrine klonters gegenereerd in aanwezigheid van UHRA (zelfs bij 0,5 mg/mL) vertoonden een vergelijkbare structuur en vezelgrootte blijft hetzelfde als normale fibrine klonters (controle vs UHRA 0,5 mg/mL klonters, p= 0,12) (figuur 3). Aan de andere kant, fibrine stolsels gevormd in de aanwezigheid van 0,05mg/mL PS (klinische dosis) verhoogde de vezel grootte en veranderde de stolsel structuur dramatisch (controle vs PS 0,05mg/mL stolsel, p< 0,0001). Onze plasma stolsel lysis studies in de aanwezigheid van exogeen t-PA tonen aan dat UHRA de afbraak van stolsels niet versterkte in tegenstelling tot protamine. UHRA herstelde de trombinespiegel in anticoagulerend PRP (gehepariniseerd) wat de werkzaamheid aantoont.

Conclusie en betekenis

Onze studies tonen aan dat het universele heparine tegengif, UHRA, een verwaarloosbare invloed heeft op fibrinogeen, fibrinepolymerisatie, stolselstructuur, stolselafbraak en het stollingssysteem, wat de uitstekende hemocompatibiliteit in vergelijking met protamine aantoont. Onze resultaten ondersteunen het feit dat UHRA een ideaal tegengif zou kunnen zijn om de hemostase te herstellen na invasieve chirurgische ingrepen en om bloedingscomplicaties door op heparine gebaseerde anticoagulantia aan te pakken.

Geen relevante belangenconflicten aan te geven.