Neutrophile Diapedese: Parazellulär oder transzellulär?

Eines der klassischen Merkmale einer Entzündung ist die Infiltration des betroffenen Gewebes durch polymorphnukleare Leukozyten (PMN). Dazu müssen die zirkulierenden PMN adhäsive Interaktionen mit dem Endothel eingehen, die es ihnen ermöglichen, aktiviert zu werden, sich abzuflachen und durch die Endothelauskleidung der Mikrogefäße zu wandern. Die molekularen Determinanten dieser adhäsiven Interaktionen wurden eingehend untersucht, und es besteht ein allgemeiner Konsens über die Abfolge der Ereignisse, die dazu führen, dass PMN in die Lage versetzt werden, in das Gewebe zu emigrieren (3, 12). Zunächst kommt es zu einer schwachen adhäsiven Interaktion zwischen zirkulierenden PMN und dem Endothel, die zu einer saltatorischen Bewegung der PMN entlang des Endothels führt, ein Phänomen, das als Rollen bezeichnet wird. Durch das Rollen bleiben die PMN in enger Anhaftung an das Endothel, und wenn lokal erzeugte Entzündungsmediatoren vorhanden sind, werden die PMN aktiviert. Nach der Aktivierung bilden die PMN stärkere adhäsive Wechselwirkungen mit dem Endothel, die zu ihrer Arretierung führen. Anschließend wandern die PMN über das Endothel aus. Im Gegensatz zu den ersten adhäsiven Interaktionen (Rolling und Adhäsion), über deren Mechanismen ein allgemeiner Konsens besteht, ist über die Mechanismen der transendothelialen Migration der PMN wenig bekannt. Selbst die Grundannahme, ob PMN zwischen Endothelzellen (parazellulärer Weg) oder durch die Endothelzellen selbst (transzellulärer Weg) wandern, ist umstritten.

Der vorherrschende Konsens besagt, dass zirkulierende PMN aus dem intravaskulären Kompartiment in das Interstitium wandern, indem sie zwischen benachbarten Endothelzellen hindurchwandern, d.h. einen parazellulären Weg benutzen (11). Sowohl in vivo- als auch in vitro-Studien mit Hilfe der Elektronen- und Lichtmikroskopie haben gezeigt, wie wandernde PMN Pseudopodien zwischen Endothelzellen ausbreiten, um die endotheliale Barriere als Reaktion auf einen chemotaktischen Gradienten zu passieren. Damit PMN den parazellulären Weg für die transendotheliale Migration nutzen können, muss die adhäsive Kopplung zwischen benachbarten Endothelzellen gestört werden und die Endothelzellen müssen sich ausreichend voneinander lösen, um die Passage der PMN zu ermöglichen. Viele Entzündungsmediatoren, die zur Simulation von Entzündungen in vitro verwendet werden, können per se die Bildung von Lücken in kultivierten Endothelzellmonolayern, d. h. die Retraktion von Endothelzellen, induzieren. Da jedoch große Lücken zwischen Endothelzellen in In-vivo-Entzündungsmodellen selten zu beobachten sind, könnte dieses Phänomen eine übertriebene Wirkung von Entzündungsmediatoren in In-vitro-Systemen darstellen. In kultivierten Endothelmonolayern sind die interendothelialen Adhäsionsverbindungen im Vergleich zu ihren Gegenstücken in vivo unterentwickelt, so dass Entzündungsmediatoren in vitro leichter eine Retraktion der Endothelzellen hervorrufen können als in vivo (12). Das in vivo-Korrelat zu diesem Phänomen ist das vermehrte Austreten von Makromolekülen über interendotheliale Verbindungen, das als Reaktion auf Entzündungsmediatoren beobachtet wird. Zusammengenommen untermauern die In-vitro-Studien die Vorstellung, dass sich Endothelzellen als Reaktion auf Entzündungsmediatoren voneinander trennen können, auch wenn das Ausmaß der Trennung möglicherweise übertrieben ist.

Der Nachweis, dass PMN die Retraktion von Endothelzellen induzieren können, stammt in erster Linie aus In-vitro-Studien, die sich mit den Mechanismen der PMN-vermittelten Endothelzellverletzung befasst haben (12). Diese Verletzung war nichtlytischer Natur und manifestierte sich als Ablösung von Endothelzellen aus Monolayern, die auf nichtporösen Oberflächen gewachsen waren. Diese Ablösung von Endothelzellen trat 3-6 Stunden nach Aufbringen aktivierter PMN auf die Oberfläche von Endothelzellmonolayern auf und wurde der von PMN stammenden Elastase zugeschrieben. Da abgelöste Endothelzellen in In-vivo-Entzündungsmodellen nur selten beobachtet werden, scheint die PMN-vermittelte Endothelzellablösung auch eine Übertreibung eines In-vivo-Ereignisses zu sein, die auf die in vitro-Versuchsbedingungen zurückzuführen ist. In diesen Systemen (Endothel-Monolayer auf nicht porösen Oberflächen) können die PMN nicht transmigrieren und sich von der Endothelzell-Monolayer entfernen. Sie verbleiben daher in unmittelbarer Nähe der Endothelzellen und führen weiterhin zu einer proteolytischen Verschlimmerung der Monolage, was schließlich zu einer Retraktion der Endothelzellen und ihrer Ablösung führt. Lässt man die aktivierten PMN durch die Endothelzellen-Monolayer wandern, wird eine grobe Endothelzellen-Retraktion und -Ablösung nur selten beobachtet.

PMN-Elastase kann eine Endothelzellen-Retraktion und -Ablösung innerhalb der Monolayer bewirken. Dies ist vergleichbar mit der Verwendung von Proteasen zur Expansion von Endothelzellen, d.h. die mit Proteasen behandelten Zellen ziehen sich zurück und lösen sich vom Substrat ab, aber nach Behandlung mit Proteaseinhibitoren können sie wieder angesiedelt werden und wachsen normal weiter. Interessanterweise können sowohl die Retraktion der Endothelzellen als auch die transendotheliale Migration der PMN durch Proteaseinhibitoren (z. B. Elastase) verhindert werden. Die letztgenannten Beobachtungen deuten darauf hin, dass PMN die endogene Elastase nutzen, um eine ausreichend starke Retraktion der Endothelzellen zu bewirken, damit sie zwischen benachbarten Endothelzellen hindurchwandern können, ohne diese zu schädigen. Neuere Studien deuten darauf hin, dass die Elastase-vermittelte transendotheliale Migration von PMN ein stark regulierter Prozess ist, der keine Degranulation der PMN erfordert (3). Die aktivierten PMN sezernieren keine Elastase in das extrazelluläre Milieu, sondern mobilisieren Elastase an der Membran und lokalisieren sie an der Migrationsfront, z. B. an den Pseudopodien, die zwischen benachbarte Endothelzellen eindringen. Dass die Degranulation der PMN für ihre transendotheliale Migration nicht notwendig ist, wird auch durch die Beobachtung gestützt, dass PMN-Zytoplasten (anukleäre PMN ohne Granula) als Reaktion auf einen chemotaktischen Gradienten ebenso effizient wie normale PMN durch endotheliale Monoschichten wandern. Auch hier kann die transendotheliale Migration der Zytoplasten durch Elastase-Inhibitoren verhindert werden.

Endothelzellen werden durch Adhäsionsverbindungen zusammengehalten, die aus Transmembranproteinen bestehen (11). Damit Neutrophile zwischen die Endothelzellen gelangen können, müssen die adhäsiven Wechselwirkungen dieser Verbindungsstellen unterbrochen werden. Es gibt zwei Adhäsionsverbindungen, die für die transendotheliale Migration von PMN relevant sind: Adherens Junctions und Tight Junctions. Adhärenzverbindungen bestehen aus vaskulär-endothelialen (VE)-Cadherin/Catenin-Komplexen. VE-Cadherin hat eine extrazelluläre Domäne, die homotypisch mit VE-Cadherin auf benachbarten Endothelzellen interagiert. Die zytoplasmatische Domäne von VE-Cadherin assoziiert mit intrazellulären β- oder γ-Cateninen. Diese VE-Cadherin/Catenin-Komplexe sind über α-Catenin mit dem Aktin-Zytoskelett verbunden (Abb. 1A). Tight Junctions bestehen aus mehreren Transmembranproteinen, darunter Occludin und Claudin 1 und 2, und assoziierten intrazellulären Proteinen wie ZO-1, -2 und -3, die die Tight-Junction-Proteine mit dem Zytoskelett verbinden. Von diesen beiden Adhäsionsverbindungen hat die Auswirkung der transendothelialen PMN-Migration auf die Adherens Junctions die meiste Aufmerksamkeit erhalten.

Spätere Studien mit konfokaler Mikroskopie deuten darauf hin, dass adhäsive PMN-Interaktionen (Adhäsion und transendotheliale Migration) zu einer lokalen Unterbrechung der Adherens Junction-Proteine führen können (10). Es wurden zwei Populationen von PMN erfasst, die an Endothelzellmonolayern anhaften: 1) diejenigen, unter denen die Kontinuität der Adherens-Junction-Proteine nicht unterbrochen war, und 2) diejenigen, unter denen die Adherens-Junction-Proteine unterbrochen waren. Die Unterbrechung der Kontinuität der Adherens Junctions durch adhärente PMN war ein lokales Phänomen, da Adherens Junctions in größerer Entfernung von den PMN nicht betroffen waren. Eine systematische Analyse ergab, dass die Proteine der Adherens Junctions unter den adhärenten PMN nacheinander betroffen waren, d. h. β-Catenin ging vor VE-Cadherin verloren. PMN, die im Prozess der transendothelialen Migration gefangen wurden, waren ausnahmslos mit dem Verlust aller Adherens Junction-Proteine am Ort der Migration verbunden. Auch hier gab es keine Auswirkungen auf die Integrität der Adherens Junctions an Stellen, die weiter von den migrierenden PMN entfernt waren. Weitere Belege für die Bedeutung der Unterbrechung der Adherens Junctions bei der transendothelialen Migration von PMN sind folgende: 1) in vivo verstärkten Antikörper gegen VE-Cadherin die Emigration von PMN, und 2) in vitro verstärkten Antikörper gegen VE-Cadherin die transendotheliale Migration von PMN und induzierten eine Reorganisation des endothelialen Aktin-Zytoskeletts, was zur Bildung von Lücken zwischen Endothelzellen führte.

In Bezug auf die Tight-Junction-Komplexe haben neuere Studien ähnliche Beobachtungen gemacht. Die transendotheliale Migration von PMN unterbricht die Kontinuität von ZO-1 und -2 nur an der Stelle, an der PMN in die interendothelialen Verbindungen eindringen (1). Weitverbreitete Unterbrechungen der tight junctions wurden nicht festgestellt.

Potenzielle Mechanismen der parazellulären Diapedese

Der Mechanismus, durch den die adhäsiven Interaktionen zwischen PMN und Endothelzellen die adherens junction unterbrechen, ist unklar. Eine Möglichkeit besteht darin, dass adhärente PMN endogene Proteasen verwenden, um Proteine der Adhärens Junction abzubauen (Abb. 1A). So konnten beispielsweise Elastase-Inhibitoren das Ausmaß des PMN-induzierten Verlusts der Adhärens Junction-Proteine VE-Cadherin und β-Catenin verringern (2). Andere Studien (11) zeigen, dass aktivierte PMN VE-Cadherin abbauen können und dass ein Elastase-Inhibitor diesen Abbau verhindern kann. Darüber hinaus erzeugt gereinigte neutrophile Elastase Abbauprodukte von VE-Cadherin, die denen ähneln, die nach dem Abbau dieser Adherens Junction-Komponente durch aktivierte PMN festgestellt wurden. Zusammengenommen scheint es wahrscheinlich, dass die von PMN stammende Elastase eine Rolle bei der Zerstörung der Adherens Junction spielt.

Die adhäsiven Interaktionen zwischen PMN und Endothelzellen könnten den Endothelzellen auch signalisieren, aktiv an der transendothelialen Migration der PMN teilzunehmen, indem sie sich voneinander trennen, d.h. eine interendotheliale Lücke bilden (Abb. 1A). Diese Behauptung wird durch die folgenden Belege gestützt. Adhärente PMN können einen Anstieg des Ca2+-Spiegels in den Endothelzellen induzieren, und die Chelatbildung dieses Ca2+ führt zu einer Hemmung der transendothelialen Migration von PMN. Darüber hinaus führte die Hemmung der endothelialen Myosin-Leichtketten-Kinase (eine Schlüsseldeterminante der interendothelialen Zellspaltbildung) zu einer Verringerung der transendothelialen Migration von PMN (11). Schließlich beeinflussen, wie bereits erwähnt, adhärente PMN das intrazelluläre β-Catenin vor dem plasmamembranübergreifenden VE-Cadherin. Zusammengenommen deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass Endothelzellen dazu veranlasst werden können, sich aktiv an der transendothelialen Migration von PMN zu beteiligen, indem sie sich voneinander zurückziehen.

Beweise für die transzelluläre Diapedese

Viele frühe und neuere Berichte, die die Leukozytendiapedese in vivo mit Hilfe eines ultrastrukturellen Ansatzes untersucht haben, deuten darauf hin, dass die meisten PMN das Gefäßsystem transzellulär verlassen, d.h., durch Poren oder Passagen, die das endotheliale Zytoplasma durchqueren. Die Untersuchung von Serienschnitten mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie legt nahe, dass PMNs durch Regionen wandern können, die nicht mit erkennbaren Zell-Zell-Verbindungen verbunden sind (4, 5, 8). Es wurde argumentiert, dass selbst Serienschnitte keinen eindeutigen Beweis dafür liefern, dass eine Zell-Zell-Verbindung nicht in der Nähe war, sondern dass sie übersehen worden sein könnte. Darüber hinaus kann es schwierig sein, elektronendichte Adhärenzverbindungen zu erkennen, insbesondere in den Regionen, in denen das Endothel <0,5 μm hoch ist. Schließlich deuten neuere In-vitro-Daten darauf hin, dass sich Zell-Zell-Adhärenzverbindungen während der PMN-Diapedese molekular auflösen (10), so dass man nicht erwarten würde, sie morphologisch zu sehen.

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen liefern überzeugendere Beweise dafür, dass PMNs durch Öffnungen in Endothelzellen eindringen, die nicht mit Endothel-Zellkontakten verbunden sind (4, 9). PMNs, die sich im Prozess der Diapedese befinden, scheinen die Form einer Hantel zu haben, mit einer Einschnürung in der Region auf Höhe des Endothels (4, 5, 7, 8, 9, 13, 15). Je nachdem, wie weit die Diapedese fortgeschritten ist, sieht man eine blasenartige Ausdehnung, die entweder in das Gefäßlumen hineinragt oder sich in das Interstitium erstreckt (5, 9, 11, 15). Dies deutet darauf hin, dass sich die Leukozyten durch eine zirkuläre Pore mit kleinem, begrenztem Durchmesser quetschen, anstatt die Retraktion einzelner Endothelzellen voneinander zu bewirken. Die Endothelzelle und der Leukozyt bleiben während der gesamten Diapedese in engem Kontakt. Das Endothel scheint sich oft entlang der luminalen Seite der PMN-Oberfläche auszubreiten, um diese vollständig zu verschlingen und so den Luminalspalt zu schließen, bevor die PMN in die Gewebematrix freigesetzt wird (4, 5, 8). Dieser Prozess wurde häufig bei der Emigration in vivo beobachtet, konnte aber bei der transendothelialen Migration in vitro nicht nachgewiesen werden.

Potenzielle Mechanismen der transzellulären Diapedese

Obwohl es schwierig ist, strenge mechanistische Ansätze in in vivo-Studien anzuwenden, gibt es genügend Indizien, die für mehrere mögliche Mechanismen sprechen, durch die PMN transzellulär emigrieren. Es ist denkbar, dass die transzellulären Poren, durch die PMN wandern, das Ergebnis einer proteolytischen Schädigung des Endothels sind. Es wurde jedoch darauf hingewiesen, dass das Endothel zumindest ultrastrukturell unbeschädigt bleibt und auch in Membranbereichen, die in engem Kontakt mit den PMN stehen, weiterhin Caveolae und endozytotische Vesikel bildet (13). Es ist wahrscheinlicher, dass die PMN, die offenbar über kurze Strecken entlang der apikalen Endotheloberfläche wandern, dünne Bereiche des Endothels, wie z. B. Fenestrae, aufsuchen. Fenestrae können geöffnet sein (50 nm Durchmesser) oder von einem Diaphragma von der Dicke zweier Plasmamembranen begrenzt werden (ohne Zytoplasma). So können die PMN leicht durch geöffnete Fenestrae oder proteolytisch durch diaphragmatische Fenestrae hindurchgehen, ohne das eigentliche Endothel zu beschädigen. Fenestrae könnten einen wichtigen Weg für die Auswanderung von PMN in Organen darstellen, die gefensterte Mikrogefäße enthalten (z. B. Magen-Darm-Schleimhaut, sekretorische Drüsen).

In Organen mit durchgängigen Mikrogefäßen (z. B. Haut, Muskeln) können die PMN Caveolae oder pinozytotische Vesikel nutzen und Filopodien in diese einfügen, um die Endothelbarriere zu durchdringen. Es wird angenommen, dass diese Strukturen mit einem Durchmesser von 50 bis 100 nm den Proteintransport durch das Endothel vermitteln und einen extrafunktionalen Weg für den Austritt von Gefäßproteinen während einer Entzündung darstellen. Kürzlich wurde gezeigt, dass Caveolae vesikulo-vakuolare Organellen bilden, die kleine kontinuierliche membrangebundene Durchgänge durch das Zytoplasma einer Endothelzelle bilden können (6). Es wurde nachgewiesen, dass sich die Bildung solcher Caveolae und Vesikel in den Membranbereichen der Endotheloberfläche fortsetzt, die in Kontakt mit anhaftenden PMNs stehen (13). Darüber hinaus strecken PMNs, die eng an der Endothelzelloberfläche haften, oft fingerartige Filopodien in Vertiefungen der apikalen Plasmamembran aus und formen so die Endotheloberfläche um (4, 7, 8). Die vorspringende Kraft eines anhaftenden Filopodiums in die sich bildenden vesikulo-vakuolaren Organellen kann zur Entstehung dieses Filopodiums an der abluminalen Endothelseite führen (Abb. 1B), wo es leicht mit der extrazellulären Matrix interagieren und sich entlang dieser ausbreiten kann (Abb. 1B).

Eine Konzentration von F-Actin und Mikrofilamenten in führenden Pseudopodien von PMN wurde während der Diapedese in vivo (15) und in vitro (3) nachgewiesen und kann die Kraft erzeugen, die erforderlich ist, um vorrückende zelluläre Prozesse durch die transzellulären Poren zu ziehen. Die Poren können sich auf eine Größe von 3-5 μm erweitern, durch die die Leukozyten leicht hindurchgehen können. Diese Erweiterung der anfänglichen Vakuolarpore kann zum Teil durch Kräfte bewirkt werden, die durch die Spannung im kortikalen Mikrofilamentsystem im kugelförmigen Teil des Leukozyten erzeugt werden, der noch in das Gefäßlumen hineinragt. Tatsächlich wurde in den späten Stadien der Diapedese eine Konzentration von F-Aktin in der kaudalen Region der transmigrierenden PMNs beobachtet (15). Darüber hinaus könnte eine Umstrukturierung des Zytoskeletts im Endothelzytoplasma die Erweiterung der transendothelialen Pore begünstigen, wie bereits früher vorgeschlagen wurde (14). Der Prozess der Porenbildung würde von einer Ausbreitung der apikalen Endothelmembranregionen entlang der PMN-Zelloberfläche begleitet werden, was schließlich zum Verschlucken der luminalen PMN-Anteile durch das Endothel führt, wie in elektronenmikroskopischen Aufnahmen gezeigt wurde (Abb. 1B). Diese aktive Beteiligung des Endothels würde zu einer schnellen Wiederabdichtung der Endothelschleimhaut beitragen und dadurch den Proteinverlust begrenzen.

Zusammenfassung

Aus dieser Übersicht über die Erkenntnisse geht hervor, dass PMN sowohl parazelluläre als auch transzelluläre Wege nutzen können, um die Endothelbarriere während einer Entzündung zu überwinden. Es ist erwähnenswert, dass die transendotheliale Migration von PMN in vitro den parazellulären Weg bevorzugt, während die transendotheliale Migration von PMN in vivo den transzellulären Weg bevorzugt. Wenn man teleologisch davon ausgeht, dass die transmigrierenden PMN den Weg des geringsten Widerstandes wählen, dann könnte es eine Erklärung für die scheinbare Diskrepanz zwischen den Ergebnissen geben, die mit in vitro und in vivo Ansätzen erzielt wurden.

In Endothelzellmonolayern, die in Kultur gezüchtet werden, befinden sich die am stärksten gedämpften Regionen in der Nähe von Zell-Zell-Verbindungen, und es ist daher nicht überraschend, dass dies der bevorzugte Ort ist, an dem Diapedese stattfindet. Außerdem sind in kultivierten Endothelzellen die interzellulären Übergänge instabile Strukturen, die ständig abgebaut und wieder aufgebaut werden. Eine solche Region wäre für die Pseudopodien der transmigrierenden Leukozyten leicht zugänglich. Es gibt auch Hinweise darauf, dass selbst in vitro der parazelluläre Weg, den PMN während der Diapedese benutzen, spezifisch ausgewählt wird, d.h. die Diapedese findet bevorzugt an trizellulären Ecken statt und nicht zwischen zwei Endothelzellen (1). An diesen trizellulären Ecken sind die Adhäsionsverbindungen und die Tight Junctions unterbrochen, was für die transmigrierenden PMN den Weg des geringsten Widerstands darstellt. Im Gegensatz dazu sind die interendothelialen Verbindungen in vivo viel besser entwickelt und widerstandsfähiger gegen die Bewegung von Proteinen über sie hinweg. Daher könnten die PMN bevorzugt Poren im dünnen Bereich der Endothelzellen, wie Fenestrae oder Caveolae, als Weg des geringsten Widerstands nutzen.

Den von den PMN während der Diapedese bevorzugt genutzten Weg (parazellulär vs. transzellulär) davon abhängig zu machen, ob In-vitro- oder In-vivo-Ansätze zur Untersuchung dieses Phänomens verwendet wurden, ist vor allem eine grobe Vereinfachung. Es gibt viele Beispiele für Abweichungen von diesem Paradigma. So gibt es beispielsweise Hinweise darauf, dass PMN in vivo den parazellulären Weg und in vitro den transzellulären Weg nutzen können. Wenn der transzelluläre Weg der bevorzugte Weg für die PMN-Diapedese in vivo ist, warum verändert dann eine Beeinträchtigung der Junktionsproteine die PMN-Diapedese in vivo so dramatisch? Es ist gut möglich, dass dieser Streit noch jahrelang andauern wird, ähnlich wie der Streit darüber, ob die transendotheliale Proteinbewegung vorzugsweise über den parazellulären oder den transzellulären Weg erfolgt. Man kann sich vorstellen, dass die Argumente bezüglich des Weges der transendothelialen Migration von PMN zum Teil auf die Art der Entzündungsreaktion oder die Beschaffenheit des Gefäßbettes, in dem sie stattfindet, zurückzuführen sein könnten. Es bleibt zu hoffen, dass weitere Studien zusätzliche Informationen liefern werden, die eine Lösung dieser Kontroverse ermöglichen.