The importance of efflux pumps in bacterial antibiotic resistance

Efflux pumps are transport proteins involved to extrusion of toxic substrates from cells within and external environment. 真核生物だけでなくグラム陽性菌や陰性菌にも存在する。1）ポンプは一つの基質に特異的であったり、構造的に異なる様々な化合物（複数のクラスの抗生物質を含む）を輸送することがあり、このようなポンプは多剤耐性（MDR）に関連することがある。 原核生物界には、MF (major facilitator)、MATE (multidrug and toxic efflux)、RND (resistance-nodulation-division) 、SMR (small multidrug resistance) 、ABC (ATP binding cassette) の5種類の排泄トランスポーターファミリーが存在する2。 これらのシステムはすべてプロトン起電力をエネルギー源としており3、ABCファミリーはATP加水分解を利用して基質の排出を行うシステムである。 近年のDNA技術の進歩とゲノム時代の到来により、上記のファミリーの新しいメンバーが多数同定され、排出ポンプの遍在性が注目されている。 抗生物質を含む複数の基質を排出するトランスポーターは、抗生物質時代のストレスに対応して進化してきたわけではない。 すべての細菌のゲノムには、複数の異なる排出ポンプが存在し、その祖先が存在することを示している。 全細菌遺伝子の約5-10%が輸送に関与しており、その多くが排出ポンプをコードしていると推定されている2,4

排出トランスポーターの「通常の」生理的役割については、抗生物質感受性菌と耐性菌がこれらの遺伝子を持っていて発現することから、いくつかの議論が存在する。 多くの場合、排出ポンプ遺伝子はオペロンの一部であり、制御遺伝子が発現を制御している。 例えば、大腸菌の胆汁酸塩やいくつかの抗生物質に対する耐性は、acrABの過剰発現によってもたらされている5。 排出ポンプをコードする遺伝子はプラスミド上にも存在するが、排出ポンプ遺伝子が染色体上に存在することにより、細菌は、抗生物質の存在という過酷な環境下で生き残るための本質的なメカニズムを獲得することになり、排出ポンプ遺伝子を過剰発現する変異型細菌は、新しい遺伝物質の獲得なしに選択することができる。 このようなポンプは、有害な物質を細菌の外に運び出し、生存を可能にするために生じたと考えられる。 実際、グラム陰性菌がグラム陽性菌に比べて特定の抗生物質に対して持つ「本質的な耐性」は、排出システムの活性の結果であると現在広く受け入れられている6。 抗生物質耐性に寄与する排出系は、Campylobacter jejuni (CmeABC7,8), E. coli (E. coli) など、臨床的に重要な多くの細菌から報告されている。 大腸菌 (AcrAB-TolC, AcrEF-TolC, EmrB, EmrD9), 緑膿菌 (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprM9), Streptococcus pneumoniae (PmrA10), Salmonella typhimurium (AcrB11) そして Staphylococcus aureus (NorA12) など、臨床上重要な細菌から抗生物質耐性に寄与する系が報告されています。 これらの系はすべてフルオロキノロンを排出し、RNDポンプ（CmeB、AcrB、Mexポンプ）も複数の抗生物質を排出する。

排出ポンプの過剰発現は、局所抑制遺伝子内の変異によるもの13-15、あるいは大腸菌のMarAやSoxSなどのグローバル転写調節因子によって制御されているレギュロンの活性化によるもの16-17がある。 ポンプを過剰発現させると、2種類以上の抗生物質や一部の染料、洗剤、殺菌剤（一般に使用されている殺生物剤を含む）に対する耐性が生じることが多いため、排出系の基質範囲が広いことが懸念される。 交差耐性もまた問題である。ポンプの基質プロファイルに属するいずれかの薬剤にさらされると、そのポンプの過剰発現が促進され、結果としてポンプの他のすべての基質に対して交差耐性を示すことになるのである。 これには、臨床的に重要な抗生物質が含まれることもある。 MexABを過剰発現する変異体は、さまざまな抗生物質（フルオロキノロン系、β-ラクタム系、クロラムフェニコール、トリメトプリム）に対して完全耐性ではないにしても感受性が低く、家庭用殺虫剤として一般的なトリクロサンにも耐性を示す18。 多剤耐性エフラックスポンプの過剰発現だけでは、抗生物質に対する臨床的に重要な耐性を付与しないことが多い。 しかし、そのような細菌は、抗生物質の圧力に耐え、抗生物質の標的部位をコードする遺伝子にさらなる変異を生じさせる能力がある23。 フルオロキノロン耐性大腸菌は、野生型菌に比べ1000倍も選択されやすいことが示されている24。高度フルオロキノロン耐性大腸菌は、標的トポイソメラーゼ酵素をコードする遺伝子に変異を持ち、蓄積性の低下と排出性の増大（ポリン発現低下と排出ポンプ過剰発現）が見られる。14,15 また、異なるクラスの複数のポンプを同時に過剰発現させると、抗生物質のMICが相加的に上昇し、高耐性大腸菌が生じることも確認されている25。

緑膿菌のMex系や大腸菌のAcrAB排出系の発現は、栄養不足の培地での増殖、定常期への増殖、浸透圧ショックなど細菌がストレスを受けたときに最も高まることが示されている；これらの非感染状態は、感染内の状況に関連していると考えられる26,27。 排出ポンプの無秩序な過剰発現は、有害な基質が排出されるだけでなく、栄養分や代謝中間体が失われる可能性があるため、細菌にとって不利になる可能性があります。 緑膿菌の研究から、Mexポンプを過剰発現する変異体は、野生型の変異体よりも環境ストレスに耐えられず、病原性も低いことが示唆されている28。 しかし、排出ポンプを過剰発現する変異体や臨床分離株は安定しており、よく分離される。このような変異体は代償変異を蓄積し、野生型細菌と同様に増殖することができるのかもしれない

最近、排出ポンプ阻害剤を用いて、輸出される抗生物質の活性を向上、増強することが検討されている。 このような戦略は、フルオロキノロン活性に対する排出ポンプの影響を低減する阻害剤の開発に利用されている。 多くの排出ポンプは構造的に大きな相同性を有しているため、1つの阻害剤化合物が異なる細菌種の様々なポンプに対して活性を示すことが期待されます。 ほとんどの研究は，緑膿菌のメキシコ流出ポンプとその阻害剤に焦点をあてている。 さらに、フルオロキノロン耐性株の選択頻度も阻害剤存在下で低下したことから、フルオロキノロン耐性菌の選択には排出が重要であることが示唆された。 S. pneumoniaeやS. aureusでも同様の結果が得られている。31 大腸菌のトポイソメラーゼ変異とフルオロキノロン耐性には、排出系が無傷であることが必要であることが示されている。 新薬の設計や既存分子の改良は、排出ポンプを念頭に置いて行われる必要がある。 抗生物質の活性を損なうことなく排出される能力を低下させるような構造変化は、より強力な化合物の開発につながるかもしれない。確かに、薬剤の「排出性」は、薬剤の全体的な有効性と耐性化の可能性を考慮して開発されなければならない。 MDRエフラックスポンプだけで高度な耐性が生じるとは限らないが、臨床分離の高度耐性菌の中にこれらの遺伝子が過剰に発現しているという関連性は無視することができない。 また、ある種の細菌の本質的な抗生物質耐性は、エフラックスポンプに大きく起因している可能性がある。 環境中に存在する殺生物剤による排出型変異体の選択は潜在的な懸念であり、そのようなプロセスによるリスクがあるとすれば、その定量化にはさらなる研究が必要である。 排出システムの過剰発現と標的部位の変異が相乗的に耐性を高め、治療が困難な高度耐性菌につながる可能性がある。 現在および将来の抗生物質の効果を最大限に発揮させるためには、今後の抗生物質の設計において、排出ポンプの影響を考慮し、阻害剤の役割を評価する必要がある。 Tel: +44-121-414-6966; Fax: +44-121-414-3599; E-mail: [email protected]