PLOS ONE

材料と方法

研究デザイン

本研究は、準実験的単群時系列デザインを用いたものである。 サンプルサイズは、11人の授乳中の女性から唾液のOTレベルについて報告した過去の研究に基づいていた 。 妊婦の血漿中OT濃度に関する先行研究では、10〜20名程度の被験者を対象としていた。 参加資格は、自然分娩による単胎児出産を予定している、妊娠38週から40週の間、アジア人で日本語の読み書きができる、産科医または助産師から参加許可を得ている、であった。 除外項目は、妊娠に関連する薬剤を服用している、内科的合併症や精神疾患がある、生殖補助医療を受けたことがある、妊娠前のBMIが3339> 25、計画分娩を行った、妊娠期間が延長した、帝王切開の経験がある、母乳育児をしている、などであった。 研究参加者の募集を示すフローチャートを図1に示す。 参加者フロー図

詳細 ”

妊娠34週の対象妊婦が妊婦健診で外来を訪れた際、看護師や産科医のいない場所で口頭で研究の説明を行いました。 同意を得た後、妊娠38週以降の最初の介入日を参加者と決定した。 その際、女性はいつでも不利益なく辞退できることを説明した上で、辞退届も受け取りました。 本研究のデータ収集施設では、37週の検診後に全妊婦を対象に骨盤検査を実施している。 妊娠39週以降は産科医の判断で膜掃引を行うこともある。

実験は病院内で連続3日間行われた。 実験前後に産科医による周産期検診を受けた被験者もいた。 データは2015年6月から2015年8月の間に神奈川県の1つの産科病院で収集された

研究プロトコルは、聖路加国際大学（東京都）の施設審査委員会によって承認された（No.15-011）。 本研究は、日本の大学病院医療情報ネットワークの臨床試験登録（UMIN000017911）に登録された.

手順

乳房刺激介入時間は3日間であった.

手順

乳房刺激介入時間は3日間であった. 日内変動の影響をコントロールするため、同じ時間帯を使用した。 唾液は10:00から16:00の時間帯に採取した。 参加者は、介入当日までに性行為と飲酒を控えるように指示された。 また、介入1時間前には食事と歯磨きを済ませ、禁煙するよう指示した。 また、口紅も使用しないように指示された。 実験は、100mLの水を摂取してから30分後に開始した。

試験開始時に、修正ビショップスコアを用いて子宮頸管の成熟度（図2；子宮頸部チェック）を評価した。 子宮頸管熟成はエンドポイントとの関連で介入を評価するためのオプションとなりうるものである。 評価者は10年の経験を持つ助産師3名で構成され、評価の標準化を図った。

拡大

病院内で介助助産師とともに3日間乳房刺激を実施した。 介入技術の標準化のため、羊毛で作成した乳房模型と圧力測定器（Perineometer, OWOMED, Gyeonggido, South Korea）を用いて助産師が10分間の乳房刺激の方法を実演した。 刺激圧は20～50mmHgを推奨とし、優しい圧力で乳首を傷つけないようにした。 刺激リズムが1分間に69回になるように、音の出ない照明用電気メトロノーム（SQ50V、セイコーウオッチ株式会社、東京、日本）をガイドとして使用した。 各乳房を右から15分ずつ，子宮過刺激を防ぐために交互に，1日合計1時間刺激した． 乳房の刺激は，親指，人差し指，中指で乳房を乳輪の外側から乳首に向かって痛くない程度につまむようにして行った。 乳房への直接の自己刺激は、「純馬油」（ソンバーユ、薬師堂、福岡県）を用いて、左右どちらかの手で行った。 乳房刺激時の他人の視線に対する不安や心配に対応するため、授乳カバーを使用した。

介入中に心電図（CTG）読影を行い、子宮活動の記録と胎児心拍数を確認した。 十分な子宮収縮は、10分以内に発生した各40秒間の収縮が少なくとも3回あることと定義された。 子宮収縮の頻度もエンドポイントとの関連で介入を評価するための可能な選択肢となりうる。 実験環境に影響を及ぼす可能性のある外的要因をコントロールするため、参加者は用意された映画（ヨーロッパ縦断鉄道旅行など）を鑑賞した。 介入後、参加者は実験的介入の実施可能性に関するアンケートに回答した。 介入終了時に子宮頸管熟成度を再測定した。

実験介入後、参加者全員に研究参加費（3000円または約30ドル）を銀行振り込みで支払った。

介入は筆者と研究補助者2名からなる3人の助産師が行った。 助産師は5年以上の臨床経験と100例以上の分娩管理経験から十分なCTG読影能力を有しており、本フィジビリティスタディに参加した。 介入の標準化のため、参加者への説明と介入内容の統一を図った。 また、筆頭著者は、研究補助者が介入手順を適切に実施できるよう、実験開始時に一貫して2回実験に参加した。 実験担当者は，助手Aが30.3％，助手Bが3.0％，残りは筆者が担当した。 また、研究補助者Aが実験を担当した日の40%は筆頭著者が病院にいて実験の標準化を確認した。

唾液採取手順

唾液測定は比較的容易に実施でき、妊婦への侵襲性も低い。 唾液中のOT濃度と血漿中のOT濃度は中程度の相関（r = 0.41-0.59）があると報告されています。 さらに、神経性食欲不振症で自己誘発性嘔吐の既往がない患者の唾液OTと血漿OTの間には正の相関（r = 0.89）が示された。

唾液サンプルは乳房刺激介入の10分前と15、30、60、75、90分後に採取し、被験者1人当たり合計18サンプルとした。 酵素結合免疫吸着法（ELISA；ENZO Life Sciences, NY, USA）によるOTレベルの測定のため、無刺激受動よだれかけで1ミリリットルの唾液を採取した。 ELISAのマニュアルによると、アッセイ内変動係数は12.6%〜13.3%、アッセイ間変動係数は11.9%〜20.9%である。

唾液採取手順を標準化するため、参加者に3分間口の中に唾液を溜めてもらった。 その後、唾液採取補助器具（Salimetrics, PA, USA）を用いて、各サンプルごとに約1.0 mLの唾液を1.5 mLポリプロピレンチューブ（Eppendorf, NY, USA）に採取しました。 3分後にこの量を採取できなかった場合、参加者は唾液採取の手順を繰り返した。 採取したサンプルは直ちに-80℃の冷凍庫（クライオポーターCS-80C、サイニクス株式会社、東京、日本）で保存した。 OT濃度はCarterらの方法で測定した． その他の実験工程では、解凍後に500 KIU/μLのアプロチニンを添加し、タンパク質分解を防いだ。

Oxytocin receptorの多型

OT receptor single nucleotide polymorphismは、OTに対する感受性を低下させると報告されている . 特にOT受容体遺伝子rs53576のGGホモ型では、遅発性活産に移行することが報告されている。 本研究では、頬粘膜サンプルを採取し、TaqMan SNP assay（Applied Biosystems, Thermo Fisher, MA, USA）を用いたジェノタイピングにより3つのOT受容体遺伝子多型（すなわち、rs53576、rs2254298、rs1042778）を分析した＜8667＞ ＜1921＞実用性と受容性の観点から見た実現性＜889＞ ＜4970＞我々は、実用性と受容性の面から乳腺刺激介入プロトコルの実現可能性を評価した． 実験方法の実用性については、分析可能な検体の割合と有害事象の発生を考慮した。 また、実験方法の受容性については、介入後の脱落率を考慮した。 本研究では、疲労と疼痛の評価には、自己報告式の尺度として最も有効で信頼性が高く、頻繁に使用される尺度の一つであるVAS（visual analog scale）を使用した。 女性は、以下のコメントと質問に対して、以下の尺度または : “乳房マッサージに関するフィードバックをお願いします; 1) 腕と指が疲れましたか? 2) 乳首に痛みはありましたか?” と “唾液採取に関するフィードバックをお願いします; 1) 唾液採取で疲れを感じましたか?” を用いて答えた。 以下の質問に回答する際には、4段階のリッカート尺度を使用した。 1）「乳首に触れて不快でしたか」、2）「刺激方法の説明はわかりやすかったですか」、3）「次の妊娠でもこの方法を行いたいですか」、4）「この方法について友人に情報提供したいですか」。 これらの設問では、東アジアの文化的背景から中点を選択する傾向があることを考慮し、曖昧さを避けるために4段階のリッカート尺度を用いて態度を測定した。 一方、刺激のリズムや強さについては、中間的な選択肢として「適度に」を含む5段階のリッカート尺度を用いた。 さらに、介入を行った環境についての質問にも回答してもらった。

データ解析

全変数の平均値（M）、標準偏差（SD）、標準誤差（SE）、中央値を算出した。 OTレベルを従属変数とし、介入日と時間を固定効果として、AR（1）共分散構造を用いた線形混合モデルを採用した。 リトルのMCAR検定が行われた。 すべてのOTレベルに加え、年齢、介入時の妊娠週数、産科歴、婚姻状況、パートナーとの同居、12年以上の教育がOTレベルに影響を与える因子として、インピュテーション手順に含まれた。 その結果、p = 0.980となり、帰無仮説は棄却されなかった。 欠損データの主な原因は唾液量の不足であり、OT値による欠損データではないため、本研究の欠損データはmissing completely at random（MCAR）を反映したものであった。 我々は、欠損データをインプットするために、SPSS Missing Valuesの多重インピュテーション手順を使用した。 5つのインピュテーションされたデータセットが作成された。 データは非正規分布であった。 唾液OTレベルと頸部スコアまたは特性との間の相関を検定するために、スピアマンの相関係数が使用された。 統計解析は、IBM SPSS Statistics（version 22.0; Static Base and Advanced Statistics, IBM Japan, Tokyo, Japan）を用いて行われた

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