Origin of electrophoretic force on DNA in solid-state nanopores

Voltage-driven transport of macromolecules through biological6,7 and artificial8,9,10,11,12 nanopores offers the ideal system for studying physics of translocation process13.This systemは固体ナノ穴における電気泳動力の起源と、電気泳動による固体分子の移動過程の研究であります。 電気泳動は、ナノ細孔を通過するDNAの移動の主な駆動力であり、高分子電解質鎖上の電荷に外部から加えられた電場が及ぼす力の結果である。 溶液中のDNAは負に帯電しているため、多かれ少なかれ移動性のある正電荷の対イオンの層によって遮蔽されており、この層にも電場がかかっているのである。 対イオンに働く力がDNAに流体力学的な抗力を引き起こし、局所的に電気力と釣り合うため、ストークス抗力だけから予想されるよりもはるかに遅い移動が起こることが長い間認識されてきた（例えば、文献1参照）。 小さな孔を通るポリマーの電気泳動移動も同様の原理に従うが、ここでは孔の形状（あるいはゲルの局所構造）がDNA周囲の流体力学的な流れのプロファイルに大きく影響し、それによって移動に対抗する抗力も変化すると考えられる1,5,14。 しかし、DNAの移動における流体力学的相互作用の明確な発現は、実験が高度化しているにもかかわらず、いまだ報告されていない3,12,15,16。 ここでは、最近開発した固体ナノ穴と光ピンセット3 を組み合わせた装置を使ってこの問題に取り組み、DNA の移動を停止させ、その後、1 本の DNA 鎖にかかる失速力を測定する（方法のセクションを参照）。 図1aに測定装置の模式図を示す。

a, Schematic diagram of the measurement apparatus. 光ピンセットを用いてDNAの転座を停止させ、DNAにかかる力を測定する。 また、ナノポアのイオンコンダクタンスも同時に測定される。 DNAの両側にある青い矢印は、電気浸透による移動流体の速度を模式的に示している。

ゲル電気泳動実験と異なり、ナノポアの実験では電場がポアのすぐ近くに限定され、電気力はDNAの短い断片に局所的に作用する。 膜が非常に薄い（約60 nm）ため、孔内の電界強度は通常約106 V m-1に達する。 また、λ-DNAは約50 nmと長いため、孔の中にあるDNAセグメントは実質的に完全に伸びていることになる。 図1bは、LとRが孔の長さと半径、ΔVが印加された電位を表しており、この状態を模式的に示している。 DNAは裸線電荷密度λbare=-0.96 nC m-1（塩基対あたり2電子）であり、ここでは半径a=1.1 nmの一様に帯電した円柱としてモデル化されています。 DNA骨格に働く裸の静電気力はFbare=λbareΔVで表されます（参考文献3）。 これは、対イオンの電気泳動による抗力Fdragが反対方向に働くためである。 したがって、Fdragは移動過程の本質的な要素であり、最終的には電気的な力に帰着することになる5。 その結果得られる正味の力は、転座を駆動する電気泳動力であり、Felec=Fbare-Fdragで与えられる。 我々の場合、Felecは、DNAを孔の中で止める光ピンセットからの対抗的な機械力Fmech=-Felecによって釣り合わせられる。 イオン分布の平均場記述はポアソン-ボルツマン形式によって与えられ、この形式では静電ポテンシャルは、対応するイオン分布はで与えられる。 ここで、λDはデバイ長、は還元静電ポテンシャル、eは素電荷、Φはポテンシャル、kBはボルツマン定数、Tは温度、nはイオンの数密度、zはイオン種の原子価である。 図2aは、円筒形状のポアソン-ボルツマン方程式の数値評価によって得られた2つの細孔サイズに対する計算ポテンシャルです（方法のセクションを参照）。 対応するイオン分布は図2bに示されている。 DNAのデバイ層はコイオンが枯渇しているのに対し、対イオンはDNAの電荷が高いために非常に高い密度で積み重なっていることが特徴的です。 これらの分布は完全な（非線形化された）ポアソン-ボルツマン方程式の解であるため、マニング凝縮の効果17が含まれています。

a, 「大きい」孔（緑、R=10nm）と「小さい」孔（青、R=3nm）の縮小した静電気電ポテンシャル。 灰色の線は小さな孔の孔壁の位置を示している。 塩濃度はcbulk=20 mM (λD=2.2 nm)で、この計算では簡単のために細孔壁は非帯電としている。 大きな孔（R≫λD）では、DNA周辺のイオン分布は孔壁の影響をあまり受けず、緑の曲線がバルクの値に達することが観察されたことからもわかる。 しかし、「小さな」細孔（R≲λD）では、対イオンの雲（実線曲線）が細孔壁によって圧縮され、細孔からイオンが枯渇し（破線曲線）、主に正の対イオンが残ってDNA上の負の電荷と釣り合うことができるようになるのです。 c, aとbの結果をストークス方程式と組み合わせて計算した流体速度プロファイル。 d, 各位置rにおけるせん断応力の正規化表面積分、として計算。 DNA表面では。e. DNA（赤）とナノ細孔壁（灰）の還元表面電位を細孔半径の関数として計算したもの。 グレー部分は、イオン分布がナノポアの閉じ込めによって影響を受ける「スモールポア」領域を定性的に示している。

我々のDNAストール実験では、対イオンの分布が誘導電気浸透流の速度プロファイルを大きく決定する。 流速分布はストークス方程式を解くことにより計算できる。ここで、ηは流体の動的粘度、vzは流体速度、Ezは印加電場、ρ(r)はイオンの電荷分布である。 計算された流体プロファイルを図2cに示す。 続いて、流動プロファイルを粘性抗力に関連付けるために、流体中のせん断応力をτ(r)=-η(dvz/dr)として計算した。 図2dはを示しており、これはDNA表面(r=a)で評価した場合の比Fdrag/Fbareに相当する。 これは、Fdragが、対抗するDNAに働く裸の静電気力と同じ大きさのオーダーであることを示している。 Fdragは孔が大きいほど大きく、失速力が小さいことに対応する。

我々の実験と比較するために、上記のモデルを電気泳動力とナノ穴の特性を直接関連付ける形で表現すると便利である。 先に示したように5、ポアソン-ボルツマン方程式とストークス方程式を組み合わせると、静止分子の電気泳動力の式が得られる、

Φ(a) と Φ(R) はそれぞれDNAとナノポアの表面電位、εは水の誘電率である。 図2eにポアソン-ボルツマン方程式から導かれるとをRの関数としてプロットした。大きな孔では、表面電位はRとは無関係であり、式（1）から測定力Fmechは孔の大きさに単純なln-1（R/a）依存性を持つことが予測される。 一方、より小さな孔では、デバイ層が孔壁によって圧縮される（図2）。 この結果、表面電位の細孔サイズ依存性が生じ、それに応じてFmechのR依存性もより複雑になる。

上記のモデルを直接検証する方法は、DNAストール力Fmechを細孔半径Rの関数として測定することです。 孔内のDNAの検出は、DNAが孔に入ったときのイオンコンダクタンスΔGのステップを測定することに基づいている。 ΔGは、体積排除によってコンダクタンスに利用できるイオンの数が減少することと、過剰なDNA対イオンによってコンダクタンスに利用できるイオンの数が実質的に増加することの2つの要因間の競合によって生じることが以前に示された12。 これらの2つの効果のどちらが優勢であるかは、電解質のバルク濃度に依存し、20-50 mMの塩を用いた今回の実験ではΔGが正になる（コンダクタンスが増加する）原因となった。 このように最適化された塩条件下では、非常に大きな孔でもDNA捕獲のS/N比が高くなることが予測される18。 図3aに、電流の典型的なステップと、それに対応するビーズの位置Zの変化を示す。 DNAがナノ穴のコンダクタンスを1%未満しか変化させないにもかかわらず、電流の明確なステップが観察される。 図3bは、捕捉イベントの典型的なヒストグラムです。 これらのデータは、DNAがナノ穴の断面積の2000分の1しかないR=45 nmのナノ穴でも、単一分子の挿入と検出が制御可能であることを示している（

a, R=39nmの孔に80mVでDNAを捕捉した際の孔電流I（上段、赤色平均）とビーズ位置Z（下段）の代表的な例です。 b, aと同じ条件下で、88個のDNAがナノ細孔に捕獲されたときのΔGのヒストグラム c, 異なる半径の細孔におけるΔG。 捕捉イベントは通常60-100 mVの電圧で発生した。 水平破線は目印である。 三角形：20 mM KCl、星形：33 mM KCl、菱形。 50 mM KCl、緑色の星印：bのデータ、エラーバー：ΔGヒストグラムから評価した標準偏差。 開いている記号は、光ピンセットなしの自由移動実験からのデータを表す。

半径がR=3から45 nmまでの10個のナノ穴について、ナノ穴半径の関数として実験的に求められたΔG値を図3cに示している。 灰色の部分は「小さな孔」領域を示しており、図2bの計算によると、DNA近傍のイオン分布はナノ孔の壁の存在に影響されていることがわかる。 シミュレーションと明らかに一致するように、ΔGは大きなナノ穴ではほぼ一定である。 小さなナノ穴でΔGが大きくなるのは、拡散遮蔽層が圧縮され、穴の中の電荷が中性になるためと考えられる。 しかし、測定されたΔGと理論とのより定量的な比較は難しい。アクセス抵抗Raccは、大きな孔ではシステムの全抵抗に対する寄与がますます重要になり19、孔を通過するDNAの存在がRaccにどのように影響するかは、現在のところ不明である。

a, 小さいナノ穴（左パネル）と大きいナノ穴（右パネル）でのストール力の測定と適用電位の関数である。 各ケースで、ビーズとナノ穴の間の異なる距離で得られた2つの測定値が示されている。 青と緑のシンボルはaのデータに対応する。小さな孔の領域のデータはref. 3. 曲線は、裸のDNAの電荷（破線）および減少したΔΦ（実線、本文参照）に対する理論的な結果を表している。 内側の図は、DNA対イオンにかかる力が、大小の孔の粘性抵抗によってDNAと孔壁の間でどのように分割されるかを模式的に示したもので、黄色の矢印はDNAに働く裸の静電気力を表しています。 三角形：20 mM KCl、星形：33 mM KCl、菱形。 50 mM KCl。 エラーバーは光学トラップの較正の不確かさに由来し、較正されたトラップ剛性の10-30%と推定される。

我々の単純なモデルでは考慮されていない外部要因が、失速力の絶対値に影響を与える可能性もあります。 例えば、ビーズにかかる静電気力や流体力学的な力、あるいはナノ穴のすぐ外側で電界中に存在するDNAの部分にかかる力によって偏りが生じる可能性がある。 しかし、我々の実験では、ビーズをナノ穴から遠ざけても失速力に変化がないことから、そのような効果を示す証拠はない3。 さらに、実験的な力-電圧曲線は我々の電圧範囲では線形であり（図4a）、エントロピー力が静電気力に比べて小さいことを示し、DNA伸長におけるエントロピー力の独自測定と一致した22。 ナノポアの形状は、対イオンがDNAに及ぼす抗力の大きさを決定する。 また、塩濃度の上昇に伴い、デバイ長が変化し、それによってDNAの表面ポテンシャルと失速力Fmechが変化するため、力の変化も予想される。 しかしこの予想は、孔の表面電荷密度も塩濃度によってかなり変化すること12、またここで用いた平均場理論が高いイオン強度では信頼できなくなることなどで複雑になっている。 以前の実験では、Fmechは1Mまでは塩濃度に依存せず（文献3）、Φ（R）が塩濃度に依存するモデルに基づくこれらのデータの解釈はGhosalによって提案された5）

自由DNA転位では、復元力Fmechはなく、分子の速度に比例する余分のストークス抵抗FStokesで事実上置き換えられる。 分子は等速で移動し、電気泳動力はFStokesと釣り合う。 光ピンセットで測定した失速力Fmechと、自由なDNA転流実験から求めた転流速度vtransの関係は次式で与えられる4,5,14

この結果は、円柱状の孔を一定速度vtransで転流する非荷電円柱が経験するであろうストークス抵抗と等価である。 したがって、Fmechとvtransは形状に依存する因子によって関連づけられた比例量である。 この予想は、Fmechとvtransが実際にほぼ比例することを示す実験データ3,12によって定性的に確認されている。 vtransをλ-DNAの輪郭長を実験的に求めた移動時間で割ると、vtrans=(16 μm/1.1 ms)≈15 mm s-1となり、Fmech/vtrans=1750 pN s m-1（半径5 nmの孔のデータ）であった。 しかし、η=1×10-3 N s m-2, L=60 nm, R=5 nm, a=1.1 nmとすると、式（2）はこの係数に249 pN s m-1を与えている。 これは、実験的に得られた値よりも7倍低い値である。 したがって、この孔を通るDNAの移動は、光ピンセットで測定した電気泳動力と平均場記述から予想される速度よりもはるかに低い速度で起こることになる。 これらの実験では、すべて同じようなナノ細孔を用いた。この結論は、静止した分子の静的状況と、移動する分子の動的状況との、より根本的な違いを指摘するものである。 3934>

結論として、我々はナノ細孔内のDNA分子に働く電気泳動力が細孔の形状に依存することを明らかにした。 これは単純な静電気学からは予想できないが、溶液中のDNAを遮蔽する対イオンによって引き起こされる流体力学的抗力を考慮すれば、素直に理解することができる。 平均場方程式に基づく数値計算により、測定された力の孔径依存性をうまく説明することができた。