Identification and characterization of a novel Botulinum neurotoxin

(a) すべてのBoNT血清型、亜型、モザイク毒素および関連破傷風神経毒（TeNT）を網羅する系統的分割ネットワークは、そのタンパク質配列に基づいて、例えばキメリズムから生じる競合と同様に、それらの進化上の関係の可能性を説明する。 BoNT/Xは赤でハイライトされている。 このパネルの拡大版を補足図1に示し、各毒素遺伝子の配列アクセス番号を記した。 (b) BoNT/A-G、TeNT、BoNT/Xのタンパク質配列のアラインメントをClustalW法で解析した系統樹である。 各毒素とBoNT/Xの間の配列同一性のパーセンテージが記されている。 (c) 上段：BoNT/Xの3つのドメインの模式図。LCの保存されたプロテアーゼモチーフとHCのガングリオシド結合モチーフを記している。 下段：配列比較ウィンドウを用いた解析により、BoNT/Xと他のBoNTs/TeNTとの低い類似性は、BoNT/Xの配列全体に渡って均等に分布していることが示された。 X軸は、100アミノ酸の移動配列比較窓の中心におけるクエリ配列の位置を表す。 Y軸はその配列ウィンドウと整列した各バックグラウンド配列の間の同一性のパーセンテージを示す。 グラフ上部の2本のバーは、ベストマッチの配列（下のバー）と、ベストマッチがセカンドベストマッチから大きく離れているかどうか（上のバー）を示している。 (d) BoNT/X遺伝子を保持するorf遺伝子クラスター（上段）の模式図であり、他の既知のorfXクラスター（中段および下段）と比較して、2つの明確な特徴を有する。 (1)BoNT/X遺伝子の隣にさらにorfX2タンパク質（orfX2bと命名）が存在する;2)orfX遺伝子の読み枠はBoNT/X遺伝子と同じ方向である。

他のBoNTs同様にBoNT/X遺伝子も遺伝子クラスターの中に位置している23。 確立された7つのBoNTはすべてNTNHA (non-toxic non-hemagglutinin protein) として知られる別の150 kDaタンパク質と共発現し、これはBoNTとpH依存性の複合体を形成して消化管内のプロテアーゼから保護する35。 BoNT/X遺伝子の前には、NTNHA遺伝子の可能性もある(Fig. 1d)。 BoNTとNTNHAの他に、典型的なBoNT遺伝子群には、2種類のアクセサリータンパク質のいずれかをコードする遺伝子が含まれている。 (1)BoNT/NTNHAと複合体を形成し、腸管上皮バリアを越えて毒素の吸収を促進する3つの保存タンパク質HA17, HA33, HA70をコードするHAクラスター36,37,38、または(2) 機能不明の保存タンパク質OrfX1, OrfX2, OrfX3, P47をコードするOrfXクラスター23のどちらかである。 BoNT/X遺伝子は、BoNT/E、F、BoNT/Aのメンバー同様、OrfX遺伝子クラスターに位置している。 興味深いことに、BoNT/Xクラスターには2つのユニークな特徴がある(Fig. 1d)。 (1)他のBoNTクラスターには存在しないOrfX2遺伝子（我々はこれをOrfX2bと命名）が追加されている、(2) OrfX遺伝子の読み枠は通常BoNT/NTNHA遺伝子とは反対であるが、BoNT/XクラスターではBoNT/X遺伝子と同じ方向を持っている（Fig. 1d）。 7602>

The LC of BoNT/X cleaves VAMP2 at a novel site

BoNT/Xの特徴を明らかにするために、まずそのLC（X-LC、1-439残基）に着目し、大腸菌でHis6タグ蛋白として作製した。 対照としてBoNT/AのLC（A-LC）およびBoNT/BのLC（B-LC）を作製し、並行してアッセイを行った。 X-LCをラット脳用洗剤抽出物（BDE）とインキュベートしても、シンタキシン1やSNAP-25には影響がなかったが、VAMP2免疫ブロットのシグナルは消失した（Fig. 2a）。 BoNTs の LC は亜鉛依存性のプロテアーゼである33。 予想通り、EDTA は X-, A-, B-LC による SNARE タンパク質の切断を妨げた (Fig. 2a)． さらに、VAMP2 の精製リコンビナント細胞質ドメイン（残基 1-93）と X-LC をインキュベートすると、VAMP2 は 2 本の低分子量バンドに変換された（Fig. 2b）、X-LCがVAMP2を切断することを確認した。

（a）X-LC はBDEとインキュベートされた。 イムノブロット解析を行い、シンタキシン1、SNAP-25、VAMP2を検出した。 シナプトフィジン（Syp）はローディングコントロールとして使用した。 A-LCとB-LCは並行して分析された。 B-LCによるVAMP2の切断はイムノブロットのシグナルを消失させ、A-LCによるSNAP-25の切断はより小さな断片（アスタリスクでマーク）を生成する。 EDTAはX-、A-、B-LCの活性をブロックした。 (b) VAMP2 (1-93)をX-LCとインキュベートした。 サンプルはSDS-PAGEとクマシーブルー染色によって分析した。 X-LCはVAMP2 (1-93)を2つの小さな断片に変換した。 (c-e) VAMP2 (1-93)をX-LCとインキュベートした。 サンプルを質量分析（LC-MS/MS）により分析し、切断されたフラグメントの分子量を決定した。 HPLCカラムから溶出されたペプチドピークは、実行時間（RT、X軸）に対してプロットされる。 2つの切断生成物の質量分析データは色分けされ、質量電荷比(m/z)が記されています。 分子量はmとzを掛け合わせ、zを差し引くことで算出した。 (g) HAタグ付きVAMP1, 3, 7, 8とMycタグ付きSec22bとYkt6を293T細胞で一過性のトランスフェクションにより発現させた。 細胞ライセートをX-LCとインキュベートし、イムノブロット解析に供した。 アクチンはローディングコントロールである。 (h）GSTタグ付きYkt6をX-LCとインキュベートした（100nM）。 サンプルは、SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色によって分析された。 (i） GSTタグ付きVAMP2（33-86）、VAMP4（1-115）およびVAMP5（1-70）をX-LC（100nM）とインキュベーションした。 サンプルはSDS-PAGEとクマシーブルー染色で分析した。 X-LCはVAMP4とVAMP5の両方を切断した。 VAMP5タンパク質は、切断産物の近くを走る汚染バンドを含むことに留意されたい。 (j）VAMP4およびSec22bを検出した以外は、aに記載したように実験を行った。 シナプトタグミンI (Syt I)はローディングコントロールである。 BDEでネイティブVAMP4をX-LCで切断した。 7602>

切断部位を特定するために、VAMP2（1-93）タンパク質を、X-LCとプレインキュベーションした場合としない場合について、液体クロマトグラフ-タンデム質量分析（LC-MS/MS、図2c-e）により分析した。 X-LCとのインキュベーション後、単一の支配的なペプチドのピークが現れた（図2c,e；補足図2）。 その分子量は3,081.7であり、VAMP2のA67-L93のペプチド配列にのみ適合する（図2c,e）。 また、VAMP2のHis6-tagの始まりからR66残基までの別の断片も検出された（図2d）。 この知見をさらに確認するため、別のVAMP2断片：グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）タグ付きVAMP2（33-86）を用いてアッセイを繰り返した（補足図3）。 X-LCとのインキュベーションにより、VAMP2のA67-R86のみに適合する分子量2,063.1の単一優占ペプチドのピークが生成された（補足図3）。 7602>

R66-A67 はVAMP2上の新規な切断部位であり、BoNTの確立された標的部位とは異なる（図2f）。 また、SNAREモチーフとして以前から知られていた領域内に位置する唯一のBoNT切断部位である（図2f、斜線部分）39。 VAMPタンパク質ファミリーには、VAMP1、2、3、4、5、7、8と、関連するSec22b、Ykt6が含まれる。 R66-A67 は VAMP1 と 3 で保存されており、VAMP2 と高い相同性を持つ。 X-LCの特異性を検証するために、HAタグ付きVAMP1, 3, 7, 8とMycタグ付きSec22bとYkt6をHEK293細胞にトランスフェクションで発現させた。 細胞ライセートをX-LCとインキュベートした。 VAMP1と3はX-LCで切断されたが、VAMP7、VAMP8、Sec22bはX-LCに抵抗性であった（図2g）。

BoNT/XはVAMP4、VAMP5、Ykt6を切断した

予想外に、Ykt6もX-LCで切断された(図2g）。 この発見は、X-LC とのインキュベーション後に低分子量バンドにシフトした精製 GST タグ付き Ykt6 断片を用いて確認されました (図 2h)。 X-LCで切断されたYkt6と無傷のYkt6を質量分析した結果、切断部位はK173-S174であると決定された（補足図4）。 この部位はVAMP2上のBoNT/Xの切断部位と相同である（図2f）。 VAMPファミリータンパク質のうち、VAMP4はこの部位にYkt6と同じ一対の残基（K87-S88）を含んでいる。 X-LCは、精製したGSTタグ付きVAMP4細胞質ドメイン（図2i）、およびBDE中のネイティブVAMP4（図2j）の両方を切断することを見出した。 コントロールとして、Sec22bはBDE中ではX-LCによって切断されなかった。 さらに、VAMP5のGSTタグ付き細胞質ドメインも切断された(Fig. 2i)。 切断部位は質量分析により、VAMP4ではK87-S88、VAMP5ではR40-S41と決定された（補足図5）。 両部位はVAMP2上のBoNT/Xの切断部位と相同であり（図2f）、切断部位の位置は異なるVAMP間で保存されていることが示された。 X-LCがVAMP4、VAMP5、Ykt6を切断する能力は、それらの配列がVAMP1/2/3と大きく異なるため、非常に珍しい。 BoNT/Xは、VAMP1、2、3以外のVAMPを切断することができる最初で唯一のBoNTである（参考文献40）。 大腸菌でリコンビナントX-LC-HNフラグメント（残基1-891）を作製し，エンドプロテアーゼLys-Cによる限定的なタンパク質分解を施した。 サンプルはTMT（Tandem Mass Tag）ラベリングとタンデム質量分析を用いて分析された。 TMTは遊離のN末端（およびリジン）を標識する。 Lys-Cによる限定的なタンパク質分解は、リンカー領域の残基N439にマッピングされた1つの新しい遊離N末端を生成し（図3a；補足データ1）、リンカー領域がプロテアーゼに感受性であることを確認した。

(a) 7つの確立したBoNTにBoNT/XのLCとHC間のリンカーの配列のアライメントを示す。 Lys-C切断部位は質量分析により同定した（方法および補足データ1参照）。 (b) 培養ラット皮質ニューロンをX-LC-HNに12時間暴露し、細胞溶解物を採取し、シンタキシン1、SNAP-25およびVAMP2を調べるためにイムノブロット分析を実施した。 アクチンはローディングコントロールである。 トリプシン活性化されたA-LC-HNとB-LC-HNは並行して分析された。 X-LC-HNは神経細胞に入り、VAMP2を切断した。 Lys-Cで活性化されたX-LC-HNは、非活性化X-LC-HNよりも大きな効力を示した。 X-LC-HNはB-LC-HNやA-LC-HNよりも強力であり、どちらも基質を切断しなかった。 (c) WTおよび変異型X-LC-HNをLys-Cで活性化し、DTTの有無にかかわらずSDS-PAGEとクマシーブルー染色で分析した。 C461SとC467S変異体はDTTなしでは約100 kDaの単一バンドであったが、DTTを加えると約50 kDaの2つのバンドに分離した。 WT X-LC-HNの一部は、アスタリスクで示したように凝集体を形成したが、DTTで消失した。 活性化されたWT X-LC-HNの大部分は、DTTなしで2つの約50kDaのバンドに分離した。 これは次のパネルで説明するように、ジスルフィド結合のシャッフリングによるものである。 (d) Lys-Cで活性化したWT X-LC-HNをNEMとインキュベートし、ジスルフィド結合のシャッフリングをブロックした。 次に、サンプルをSDS-PAGEとクマシーブルー染色によって分析した。 WT X-LC-HNの大部分は、NEM処理後DTTなしで約100kDaの単一バンドとして存在し、ネイティブWT X-LC-HNが鎖間ジスルフィド結合を含むことを示す。 (e) BoNT/XのWTと3つのシステイン変異体におけるジスルフィド結合の模式図である。 (f) ニューロンをWTまたはX-LC-HN変異体に暴露した以外は、bに記載されたように実験を実施した。 C423S変異はX-LC-HNの活性を消失させたが、C461またはC467を変異させてもX-LC-HNの活性には影響がなかった。 これらの結果から、X-LC-HNの活性には鎖間ジスルフィド結合が必須であり、この鎖間ジスルフィド結合はC423-C461またはC423-C467のいずれかを介して形成されることが確認された。 7602>

次に、タンパク質分解活性化がBoNT/Xの効力を増強するかどうかを検討した。 高濃度のBoNTのLC-HNを培養神経細胞とインキュベートすると、おそらく非特異的に神経細胞に取り込まれることによって、LC-HNの侵入が起こることが示された41。 同様に、X-LC-HNはラット大脳皮質培養神経細胞に入り、濃度依存的にVAMP2を切断した（Fig.3b）。 Lys-Cによる活性化でX-LC-HNの効力は増大した。10 nMの活性化X-LC-HNは150 nMのインタクトX-LC-HNと同程度のVAMP2を切断した（図3b）。 活性化X-LC-HNは、同じアッセイ条件下で基質の検出可能な切断を示さなかったBoNT/A（A-LC-HN）およびBoNT/B（B-LC-HN）の活性化LC-HNより強力なようだ（Fig. 3b）。

BoNT/Xの鎖間ジスルフィド結合

他のBoNTと同様、BoNT/Xのリンカー領域には2つの保存システインがあるが、BoNT/Xに特有のシステイン（C461）も追加されている（Fig.3a)。 鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を決定するために、3つのシステイン残基のうち1つを変異させたX-LC-HN変異体（C423S、C461S、C467S）をそれぞれ作製した。 これらの変異体および野生型（WT）X-LC-HNをLys-Cで限定的にタンパク質分解し、還元剤ジチオスレイトール（DTT）ありまたはなしでSDS-PAGEとクマシーブルー染色により分析した（図3c）。 LC上の唯一のシステインを変異させることにより（C423S）、鎖間ジスルフィド結合が消失することが期待される。 C423S変異体はDTTなしで2つの約50 kDaのバンドに分離した。 一方、C461SとC467S変異体はDTT非存在下では100 kDaの単一バンドを示し、DTT存在下では50 kDaの2つのバンドに分離した。 これらの結果から、LC上のC423はHC上のC461またはC467と鎖間ジスルフィド結合を形成することができることが示唆された。 また、Lys-C処理によりC423S変異体はC461SやC467S変異体に比べてかなりの部分が分解されたことから（図3c、+DTT）、鎖間ジスルフィド結合を失うとプロテアーゼに対してより感受性が高くなることが示唆された。 また、WT X-LC-HNの一部は、SDS-PAGEゲルの上部に凝集体を形成していた（図3c、アスタリスクで示す）。 これらの凝集体は、DTTの存在下で消失した。 C423/C461/C467はX-LC-HNに含まれる唯一の3つのシステインであり、そのいずれかを変異させると凝集体の形成が消失することから（図3c、-DTT）、これらの凝集体はリンカー領域の余剰システインの存在による分子間ジスルフィド結合により形成されていると考えられる。

興味深いことに、活性化したWT X-LC-HNの大部分はDTTなしで2つの約50 kDaのバンドに分離し（図3c）、これはC423S変異体と同様であった。 一方、WT X-LC-HNはC423S変異体と比較して、Lys-Cによる分解の増加は見られなかった（図3c、＋DTT）。 これは、WT X-LC-HNでは鎖間ジスルフィド結合が存在するが、SDSバッファーを用いた変性条件下では鎖内C461-C467対に再配列するためであると考えられる。 この現象はジスルフィド結合のシャフリングとして知られており、隣接するシステイン間でしばしば起こる。 この仮説を検証するために、アルキル化試薬であるN-エチルマレイミド(NEM)を用いた。 図3dに示すように、NEMで前処理したWT X-LC-HNは、DTT非存在下では100 kDaの単一バンドを示し、DTT存在下では50 kDa程度の2つのバンドに分離した。 これらの結果から、WT X-LC-HNは主に鎖間ジスルフィド結合を持つが、リンカー領域の余分なシステインによりジスルフィド結合のシャッフリングを受けやすいことが確認された（図3e）＜7602＞＜4159＞さらに3種のX-LC-HNシステイン変異体の培養ニューロンに対する活性について検討した。 予想通り、C423S変異体は不活性であったが、C461SおよびC467S変異体はいずれもWT X-LC-HNと同程度の活性を示した (図3f)。 7602>

Generating full-length BoNT/X via sortase-mediated ligation

次に，完全長のBoNT/Xが機能的な毒素であるかどうかを調べた． BoNT/X に対する抗血清がないため、完全長の活性毒素遺伝子を作製しないことにした。 その代わりに，BoNT の無毒な 2 つの断片を酵素的にライゲーションして，試験管内で限定量の完全長 BoNT を生成する方法を開発した． この方法は、Sortase42,43 として知られるトランスペプチダーゼを利用するもので、ペプチドモチーフ LPXTG を認識して T-G 間を切断し、同時に N 末端のグリシンを含む他のタンパク質/ペプチドと新しいペプチド結合を形成する（図 4a）。 我々はBoNT/Xの2つの無毒性断片を作成した：(1) LPETGGモチーフとC末端に融合したHis6タグを持つLC-HN、(2) GSTタグ、トロンビン切断部位、N末端の追加グリシン残基を持つBoNT/XのHC (X-HC) である。 トロンビンによって切断されると、N末端に遊離のグリシンを持つX-HCが遊離する。 この2つのフラグメントをソルターゼとインキュベートすると、少量の約150 kDの完全長BoNT/X (X-FL, Fig. 4a,b) が生成された。 X-HCは溶解性が悪く、凝集傾向が強いので、ライゲーション効率が悪いと思われる（Fig.4b）。 一方、X-LC-HN を BoNT/A の HC（A-HC）とライゲーションすると、X-LC-HN の大部分が XA キメラ毒素にライゲーションされ、より良い効率が得られた（補足図 6a）。 バイオセーフティを確保するために、反応中の前駆体断片の量は、機能アッセイに必要な最小量のライゲーション毒素を生成するために厳密に制限されている。

(a)sortase ligation methodの概略図である。 (b)ソルターゼライゲーション反応混合物をSDS-PAGEとクーマシーブルー染色で分析した。 アスタリスクは分子間のジスルフィド結合によるタンパク質の凝集を示す。 完全長BoNT/X (X-FL)はソートアーゼライゲーション混合物中にのみ出現した。 (c) ソートアーゼライゲーション混合物（15μl）またはコントロール混合物に培養液中で12時間暴露した神経細胞。 細胞溶解物をイムノブロットで分析した。 X-LC-HNとX-HCの両方を含む混合物（ソルターゼは含まない）は、X-LC-HN単独よりもわずかに多くのVAMP2を開裂した。 ソルターゼによるX-LC-HNとX-HCのライゲーションは、VAMP2の切断をさらに促進し、ライゲーションしたX-FLが神経細胞上で機能することを実証している。 (d) BoNT/A-G, BoNT/DC, BoNT/Xを4種のウマ抗血清（3価の抗BoNT/A, B, E, 抗BoNT/C, 抗BoNT/DC, 抗BoNT/F）、および2種のヤギ抗血清（抗BoNT/Gと抗BoNT/D）でドットブロッティングアッセイに供試した。 BoNT/XはX-LC-HNとX-HCを1:1のモル比で混合したものである。 これらの抗血清は対応する標的毒素を認識したが，BoNT/Xを認識するものはなかった． BoNT/DCとBoNT/Cに対する抗血清は、これら2つの毒素がそのHCドメイン内で高い類似性を共有しているため、交差反応を示した。 (e) ラット大脳皮質培養神経細胞を、2種類の抗血清の組み合わせで、12時間、培養液中で結紮したX-FLに暴露した。 Ab1：3価の抗BoNT/A/B/E、抗BoNT/Cおよび抗BoNT/F。 Ab2：抗BoNT/Gおよび抗BoNT/D。 3価の抗BoNT/A/B/Eは1:50の希釈で使用した。 その他の抗血清は1:100希釈で使用した。 どの抗血清もX-FLによるVAMP2およびVAMP4の切断に影響を与えなかった。 これらの抗血清の特異性と効力は、補足図7に記載したように、同じアッセイで標的血清型を中和する能力について検証された。 (f）ソルターゼ反応により連結したX-FL（0.5μg）をマウスの右後肢の腓腹筋に注射した（n＝4）。 左後肢は毒素を注入せず、コントロールとした。 (g) BoNT/Xの完全長不活性型（BoNT/XRY）をHis6タグ付き組換えタンパク質としてE. coliで精製した。 さらに精製したBoNT/XRYを補足図8bに示す。 2つ（e）または3つ（c，d）の独立した実験のうちの1つを示す。

我々はまず、ラット皮質培養ニューロンを用いて結紮したBoNT／Xの活性を分析した。 ニューロンは、培養液中でソルターゼライゲーション混合物およびコントロール混合物にさらされた。 図4cに示すように、X-LC-HN単独では、反応混合物中の濃度が高いため、一部のVAMP2が切断された。 ソルターゼを含まないX-LC-HNにX-HCを混合すると、X-LC-HN単独と比較してVAMP2の切断がわずかに促進されたことから、X-HCは非共有結合でX-LC-HNと結合している可能性が示唆された。 A-HCをX-LC-HNと混合しても、神経細胞におけるVAMP2の切断は促進されなかったことから、この相互作用は特異的であるようだ（補足図6b）。 ソルターゼによってX-LC-HNとX-HCをライゲーションすると、ソルターゼなしのX-LC-HNとX-HCの混合物と比較して、VAMP2の切断が明らかに促進された（図4c）。 これらの結果から、X-HCは細胞をターゲティングする機能を持ち、結紮された全長BoNT/Xは神経細胞に入り、VAMP2を切断することが示された。 7602>

BoNT/X は既知のBoNTに対する抗血清では認識されなかった

次に，BoNT/X が血清学的にユニークであることを確認するために，7 種類の血清型と1種類のモザイク毒素 (BoNT/DC) を含む既知の BoNT に対する抗血清を用いて dot blot assay を実施した． 4種のウマ抗血清（3価の抗BoNT/A，B，E，抗BoNT/C，抗BoNT/DC，抗BoNT/F）および2種のヤギ抗血清（抗BoNT/G，抗BoNT/D）が使用された． これらの抗血清の特異性と効力は、まず培養神経細胞上のBoNTsを中和する能力を分析することによって検証された。 予想通り，すべての抗血清は，異なる血清型の活性に影響を与えることなく，標的のBoNTsを中和した（Supplement Fig.7）． これらの抗血清はドットブロットアッセイで対応するBoNTsを認識したが，BoNT/Xを認識するものはなかった（図4d）． ソルターゼを介したライゲーションによって生成された X-FL は、まずトリプシンを用いた限定的なタンパク質分解で活性化された。 トリプシンを用いると、トリプシン阻害剤を用いてタンパク質分解を止めることができるため、機能アッセイにはLys-Cの代わりにトリプシンを用いてX-FLを活性化した。 活性化したX-FLはラット大脳皮質培養神経細胞に入り、濃度依存的にVAMP2とVAMP4の両方を切断した（図4e）。 既知のBoNTに対する抗血清（Ab1（ウマ抗血清）：3価の抗BoNT/A、BおよびE、抗BoNT/C、および抗BoNT/F；Ab2（ヤギ抗血清）：抗BoNT/Gおよび抗BoNT/D）の組み合わせは、これらの抗血清存在下でVAMP2およびVAMP4切断が同程度だったことからわかるように、結紮したX-FLの活性には影響しなかった（図4e）。 これらの結果から，BoNT/Xは新しいBoNT血清型であることが確認された。

BoNT/X induced flaccid paralysis in vivo in mice

次に，BoNT/Xがin vivoで活性があるかどうかを，マウスの後肢筋へのBoNTの注射後の局所筋麻痺44を測定する Digit Abduction Score (DAS) assayとしてよく知られた非致死アッセイを用いて決定しようとした． BoNTs は四肢筋の弛緩性麻痺を引き起こし，これは驚愕刺激に応答して足指を広げられないこととして現れる． 我々は，結紮した X-FL（0.5 μg，トリプシン処理で活性化）をマウスの右後肢の腓腹筋に注射したところ，典型的な弛緩性麻痺と足指の開脚不全が誘発され（Fig. 4f），BoNT/Xが生体内で弛緩性麻痺を起こすことが示された． 我々は、このアッセイにおける結紮X-FLの効力は、他のBoNTsよりもはるかに低いようであることに注目する。 結紮型X-FLの低毒性をさらに確認するために、我々はマウスに1μgの結紮型X-FLを腹腔内注射した（n＝3）。 この投与量では、全身への影響を示すマウスはなく、全員が生存した。 7602>

全長不活性BoNT/X

最後に、中和抗体作製のための試薬として、BoNT/Xの不活性突然変異体を開発した。 BoNT/A の 2 つの残基 (R362A/Y365F) の変異は LC のプロテアーゼ活性を不活性化し，BoNT/A の in vivo 毒性を消失させる45,46. これら 2 つの残基は BoNT/X に保存されている． BoNT/X に対応する変異（R360A/Y363F）を導入し，BoNT/XRY と名付けた全長不活性型が生成された． 図4gに示すように、BoNT/XRYはHis6タグ付きタンパク質として大腸菌で精製され、培養神経細胞に対する活性はなかった(補足図8a)。 さらに、30μgのBoNT/XRY（トリプシン処理により活性化）をマウスに腹腔内注射しても副作用はなく（n=5）、生体内では毒性がないことが実証された。 BoNT/XRYのかなりの部分は、SDS-PAGEゲルの上部に凝集体を形成した（図4g）。 DTTを添加すると、これらの凝集体は単量体のBoNT/XRYに減少した(Fig. 4g)。 このように、完全長BoNT/Xは、分子間ジスルフィド結合を形成しやすいことがわかった。 しかし、BoNT/X の単量体は精製可能であり、溶液中で安定である (Fig. 4g)。 さらに、スケールアップ精製プロトコルを開発し、培養 1 リットル当たり約 3 mg の収量と約 90% の純度で BoNT/XRY を生成した（補足図 8b）。 また、高純度化したBoNT/XRYは、還元剤存在下で10 mg ml-1まで溶液中で安定に保持された。 この無毒化されたBoNT/XRYは、中和抗体作製のための貴重な試薬となるであろう。