Articles / 1月 19, 2022

Frontiers in Physiology

Introduction

HUMAN GENOMEプロジェクトは、RNAが細胞プロセスの中心的な多才な制御因子として登場したことで、遺伝情報の基本単位に関する我々の理解を一変させた（Thum and Condorelli, 2015）。タンパク質をコードしない転写産物である非コードRNA（ncRNA）は、最大のクラスを構成し、任意に低分子（<200ヌクレオチド）と長鎖非コードRNA（lncRNA、>200ヌクレオチド）に分類される。マイクロRNA（miRNA）は、最もよく研究されている低分子ncRNAであり、摂動を吸収し、生物学的システムの頑健性を確保する転写後制御因子の追加層を表す（Liu and Olson, 2010; Ebert and Sharp, 2012; Rotllan et al.、2016）＜7994＞＜2157＞現在、かなりの努力がlncRNAの機能を解剖することに向けられてきた。循環器系では、lncRNAが生理および疾患において重要な役割を果たすことが報告され、新規治療介入のためのlncRNAの標的化が検討されている（Uchida and Dimmeler, 2015; Boon et al., 2016; Buhrke et al., 2018）。ここでは、循環器系におけるlncRNAの機能に関するユニークな洞察を提供できるRNA構造を決定するための実験ツールについて説明します7994>

Challenges in Assessing lncRNA Functionality

lncRNA特有の特徴については幅広く調査されています（Guttman and Rinn, 2012; Ulitsky and Bartel, 2013; Bar et al, 2016; Ulitsky, 2016）。 lncRNAのいくつかの特徴は、機能評価を困難にしています。一般的に、lncRNAは、一見すると制約のない大きな配列に囲まれた保存塩基の「パッチ」だけを示す種間で保存性が低い（Ponjavicら、2007年；Guttmanら、2009年；Necsuleaら、2014年；Washietlら、2014年）。さらに、lncRNAは、その作用様式および部位を制限する低い存在量を示す（Mercerら、2008；Cabiliら、2011、2015；Washietlら、2014；Ulitsky、2016；Wilkら、2016；JanduraおよびKrause、2017）。機能様式については、シス制御活性とトランス制御活性の両方が記述されている（Mercer and Mattick, 2013）。シスレギュレーターとして、lncRNAは転写元となる同一アレル上の近隣遺伝子に機能を発揮し、アレル特異的に発現相関と摂動を示す。エンハンサー関連lncRNAであり、ヒト心筋前駆細胞における心臓の仕様の重要な制御因子であるCARMENは、シスで作用してmiR-143/145の発現を制御することが示されました（Ounzain et al.、2015）。一方、トランスで作用するlncRNAは、クロマチン状態を変化させ、核構造に影響を与え、またはタンパク質機能を調節することによって、その転写部位から離れた場所で遺伝子発現を制御できる（Vance and Ponting, 2014; Kopp and Mendell, 2018）

興味深いことに、いくつかの低存在lncRNAについては転写物自体よりも転写行為が重要であると思われる。 Engreitzら（2016）は、画期的な研究で、lncRNAを生成する12のゲノム遺伝子座を遺伝的に操作し、5つの遺伝子座がシスで隣接する遺伝子の発現に影響を与えることを発見しました。 lncRNAの転写物の発現自体は必要ではなく、その転写に関連するプロセスが重要であった（Engreitzら、2016）。

The RNA Interactome

lncRNAの上記の機能多様性は、タンパク質、RNA、DNAと異なる構造および分子相互作用に適合する能力から生じる（Guttman and Rinn, 2012; Marcheseら、2017）。リボ核タンパク質複合体（RNP）において、lncRNAは複合体を安定化させる足場として機能し、特定の細胞内位置またはDNAに誘導する可能性があります。内皮細胞では、lncRNA MANTISとATPase触媒サブユニットとの相互作用により、スイッチ／スクロース非指定（SWI／SNF）クロマチンリモデリング複合体に特異性を与え、それを血管新生遺伝子のサブセットに向け、ヌクレオソームの再構築と転写開始を促進します（Leisegangら、2017；ZampetakiとMayerら、2017）。実際、SWI/SNF複合体の特定のATPaseサブユニットへのlncRNAの結合は、共通の制御機構である（Cajigasら、2015；Zhuら、2016）。

これらのlncRNA-RNPはクロマチン修飾機構への干渉を通じてクロマチン修飾を誘発し得るため、lncRNAとクロマチン複合体の相互作用は特に重要である（Tsaiら、2010；Brockdorff、2013；Simonら、2013）。心臓では、Chaer a cardiac enriched lncRNAは、ポリコム抑制複合体2（PRC2）に干渉し、心肥大に関与する遺伝子でH3K27m3を阻害することにより、エピジェネティックスイッチとして作用する（Wang et al, 一方、中胚葉信仰を決定するlncRNA Fendrrは、PRC2およびTrithorax group/MLL (TrxG/MLL) 複合体の両方に結合し、ファインチューナーとして作用することができる (Grote et al., 2013)

タンパク質以外に、lncRNAとDNAの相互作用も記載されている。これは、生体内に広く存在し、lncRNAによる標的遺伝子の認識を容易にする構造であるRNA-DNA三重鎖の形成につながり得る（Mondal et al.、2015）。この相互作用は、線維化を促進する心筋線維芽細胞に富むlncRNAであるMEG3においてエレガントに示されました（Piccoli et al.、2017）。 MEG3はPRC2複合体と相互作用し、GAリッチ配列結合部位を介してRNA-DNA三重鎖構造を形成しています。クロマチンRNA免疫沈降法により、MEG3がTGF-b経路遺伝子の活性を調節し、標的認識は三重鎖構造を介して起こることが明らかになった（Mondalら、2015）＜7994＞＜2157＞ロングノンコーディングRNA調節機能もRNA-RNA相互作用に依存している。 miRNAとのクロストークは、遺伝子発現の転写後制御を発揮する複雑なネットワークを形成する。 LncRNAはmiRNAの結合部位を持ち、miRNAを他の転写産物から隔離する分子デコイやスポンジとして機能することができる。注目すべきは、標的mRNAへの結合をめぐるlncRNAとmiRNAの間の競合が報告されており、遺伝子発現の抑制解除につながることです（Yoonら、2014年；Ballantyneら、2016年）。最後に、lncRNAは埋め込まれたmiRNA配列を含み、miRNAの供給源として機能する可能性がある（Piccoli et al., 2017）

RNA構造と機能の関連性

RNA分子は高次三次相互作用（Staple and Butcher, 2005; Wan et al., 2011）を採用している。構造と機能の関連は明らかになりつつあるが、RNAインタラクトームを支配する構造ドメインはまだ十分に定義されていない。転写産物構造の機能的な意味は、一次mRNA（primiRNA）から成熟mRNAへの処理においてよりよく理解されている。複数の変異誘発アッセイを使用して、効果的なmiRNA生合成に寄与するステム長、ヘアピン対、バルジサイズと位置、アピカルループサイズなどの二次構造が定義されました（Auyeungら、2013、FangとBartel、2015、Nguyenら、2015、Rodenら、2017）。また、複数のmiRNA遺伝子からなるクラスター型miRNAでは、3次構造が個々の成熟miRNAへのプロセッシングに寄与していることが提唱されました。 miR-17∼92クラスターでは、その成熟と保存された末端ループへの補助因子の結合において、3次構造の自動調節的な役割が示された（Chakraborty et al.、2012）。最近、miR-497∼195クラスターにおいて、miR-195aヘアピンの変異が同じクラスターに存在するmiR-497aのプロセッシングに影響を与えることが報告された。計算機解析により、成熟過程に影響を及ぼすと考えられる変異体におけるprimiRNAの3次構造の違いが浮き彫りになりました（Lataniotis et al.、2017）。別の点では、primiR-30c-1では、3次構造が、primiRNAの認識とプロセシングを促進するSRタンパク質ファミリーメンバーであるSRSF3との相互作用を促進します。単一のG/A配列変異は、ステムと成熟miRNAの生成の基底部に配置された保存残基に影響を与えるprimiRNAの頂部領域の構造再編成につながる（Fernandez et al, 2017）。

lncRNAにおいて、一次配列ではなく構造に作用する選択は、進化の速さを説明する可能性があり、その結果、選択は構造ドメインに作用するという見解に基づく「RNAモジュールコード」仮説が生まれた（Wutzら、2002；Tsaiら、2010；GuttmanとRinn、2012）。この概念を支持する実験的証拠もある。 MEG3 lncRNA遺伝子には、3つの異なる構造モジュールM1、M2、M3があります。欠失分析により、モチーフM2とM3がp53の活性化に重要であることが示された。興味深いことに、M2モチーフの一次配列の半分を、同様の二次構造を示す全く関連のない人工配列で置換したハイブリッドMEG3転写物は、p53媒介転写を刺激して完全に機能した（Zhang et al.、2010）。酵素プロービングは、対になっているRNAと対になっていないRNAに結合し、それを消化して分析可能なRNA断片を生成するヌクレアーゼに依存する。一方、ケミカルプロービングでは、溶媒にアクセス可能なヌクレオチドに反応し、共有結合で修飾する小さなサイズの化学物質が使用される。修飾または切断後、通常、逆転写によって位置をマッピングし、cDNAを停止または変異を導入する（Wilkinsonら、2006年）。その後、得られたcDNAの解析により、ヌクレオチドの位置と修飾頻度が決定される。次世代シーケンス（NGS）を適用して、cDNA産物の配列を直接決定することができる。これにより、1回の実験でトランスクリプトーム全体のレベルでRNAの構造特性を明らかにすることができます（Lucksら、2011；Incarnatoら、2014；Loughreyら、2014；Rouskinら、2014）。当初はin vitroでのRNA構造解析のために確立された技術であったが、主に膜を素早く拡散できるプローブを用いたin vivoでの構造特性評価も報告されている（Spitale et al., 2013; Ding et al., 2014; Spitale et al., 2015; Flynn et al, 2016）。

Enzymatic Probing

PARS

PARS (parallel analysis of RNA structure) は、インビトロで再成熟させ、RNase V1 または S1 で処理した分離ポリアデニル化転写プールの構造特性を測定するハイスループット酵素プローブ手法である。 RNase V1およびRNase S1は、それぞれ二本鎖および一本鎖RNAの3′ホスホジエステル結合を切断し、二本鎖または一本鎖のコンフォメーションを評価できる (Kertesz et al., 2010)。

Frag-Seq

Frag-Seq (fragmentation sequencing) は、核酸酵素P1を使って一本鎖のRNAを特別に切断する酵素的手法である。その後、生成されたフラグメントをハイスループットなシーケンサーで解析する。このワークフローは、クロマチンのDNase過敏性アッセイに例えられる「RNAアクセシビリティープロファイル」を提供する(Underwood et al., 2010)。注目すべきは、Frag-seqはRNase P1切断後の<200塩基の断片を単離するため、大きなRNAが十分に表現されない可能性があることである。 Frag-seqとPARSは補完的なデータを提供できるため、この2つのアプローチを組み合わせることで、ゲノム全体のRNA構造測定の精度を向上させることができる（Wan et al, 7994>

Chemical Probing

DMS Probing

ジメチル硫酸（DMS）は、対になっていないアデノシンおよびシトシンヌクレオチドのメチル化状態に結合して変更できる塩基特有の試薬です（Tijerina et al.2007; Rouskin et al.2014). DMSフットプリンティングは、RNAの構造解析に最適化されています。 RNAにタンパク質が結合すると「フットプリント」が生成され、RNA構造の変化により追跡することができます。評価できる転写産物のサイズはやや小さい（<500 nt）ですが、DMSは細胞膜を容易に透過するため、この方法はin vitroとin vivoの両方で実行できます。 DMSメチル化とNGSを組み合わせたDMS-seqは、最近in vivoで実施された（Ding et al. その後、RNAを細胞から分離し、逆転写反応に遺伝子特異的なプライマーを用いてメチル化部位を決定する。 DMS由来の断片の塩基配列を決定することで、RNAの細胞内コンフォメーションを評価することができる。この方法に基づいて、Xist内の要素の構造モデルが開発されました（Fang et al.、2015）。

SHAPE

SHAPE（selective 2′-hydroxyl acylation by primer extension）は、化学物質NMIAおよびその誘導体を用いてin vitroおよびin vivoでRNA構造を調べ、RNA二次構造における柔軟な領域を検出できる（Wilkinson et al.2006; Weeks and Mauger, 2011）。シグナル／バックグラウンド比を向上させるために、いくつかのSHAPE試薬がテストされてきた（Lee et al.、2017）。 SHAPEでは、4つのヌクレオチドすべての2′-ヒドロキシル基は、柔軟で対になっていないときに選択的にアシル化される。その結果、共有結合のSHAPE付加物が形成され、逆転写をブロックして切断されたcDNA断片につながる。 SHAPEの反応性は、二次構造のモデル化や、RNAのダイナミクスを変化させるあらゆるプロセスの定量化に利用することができる。当初、HIV-1 RNAゲノムを定義するために実施・報告されたSHAPE-MaPは、新しい機能モチーフの迅速なde novo発見と直接検証を可能にした高感度技術です（Siegfriedら、2014； Mustoeら、, 2018）。

In-cell SHAPE-Seq

In-cell SHAPE-Seqは、SHAPE-seqを遺伝子発現測定と組み合わせ、生体内のRNA構造と機能の関連性を解明するSHAPE-seq手法の改良版である。 7994>

icSHAPE-seq

icSHAPE-seq（in vivo click SHAPE sequencing）は、細胞内SHAPE化学物質NAI-N3を使用し、その後、S/N比の改善をもたらすNAI-N3-modified RNAの選択的化学濃縮を行います（Flynn et al.、2016年）。フォローアップNGSにより、1塩基分解能での正確な同定が可能です。マウス胚性幹細胞では、in vitroのRNAフォールディングは配列によって完全にプログラムされることが示されたが、in vivoでは、RNA構造は細胞内環境の文脈やRNA結合タンパク質との相互作用に依存し、局所的な構造再配列を引き起こすことがある（Spitaleら、2015年）。したがって、このアッセイは、刺激の有無にかかわらず、in vivoでRNA構造体を見ることができるエキサイティングな可能性を提供します。

RNA Structurome and Interactome Determination

PARIS

PARIS (psoralen analysis of RNA interactions and structures) は、生体内のRNA構造と相互作用を測定するために最近開発されました。これは、非常に特異的で可逆的な核酸架橋剤であるpsoralen-derivative 4′-aminomethyltrioxsalenを用いて、生きた細胞内で塩基対を固定するものである。その後、RNaseの部分消化とプロテイナーゼの完全消化により、架橋され直接塩基対を持つ一連の小さなRNA断片が精製される。二次元電気泳動による架橋断片の精製、二重鎖RNA断片の近接ライゲーション、架橋の反転、ハイスループット配列決定により、断片間の直接塩基対形成が明らかにされた。これらの読み取りに基づいて、RNAの構造と相互作用のモデルを高い特異性と感度で生成することができます（Lu et al.）この方法を用いて、Xistの高次構造のモデルが問い直されました（Lu et al.、2016）。 7994>

lncRNA Structure Determination

lncRNA in vivoの構造決定は、塩基対が明確に定義された領域、塩基対のない領域、複数の構造を持つ領域など非常に異種性が高いため、非常に困難であると言えます。さらに、lncRNAは数千ヌクレオチドにまたがることがあり、発現量が少なく、多成分複合体の一部となる傾向がある（Busan and Weeks, 2017）。それでも、いくつかのlncRNAの構造は実験的に決定されている（表1）

TABLE 1

TABLE 1. lncRNAの構造決定.

Xist

これはX染色体の不活性化を制御する非常に長いlncRNA（17000塩基）である。 PRC2複合体のリクルートとH3K27me3抑制的クロマチン修飾の濃縮により安定したエピジェネティック修飾を誘発しながら染色体全体に広がる（Simonら, 2013; Fangら, 2015; Smolaら, 2016）。 In vivo SHAPEデータにより、構造的に可変で動的な領域によってリンクされた明確に定義された二次構造を形成するXistの33領域が特定された。

RepA

これはXist遺伝子センス鎖の内部プロモーターによってコードされる1600塩基のマウスlncRNAである。 in vitroでのSHAPEとDMSケミカルプローブを適用し、3つの独立したフォールディングモジュールの複雑な構造を明らかにした。系統解析と計算機による3Dモデリングにより、タンパク質パートナーの不在下で自律的に形成できる、定義された3次アーキテクチャが示された（Liu et al. X1、2上のRNA（roX1、roX2）はそれぞれ3,700塩基、1,200塩基の長さである。 In vitro SHAPEプロービングとPARS解析により、男性特異的致死複合体の標的部位と集合プラットフォームとして機能すると考えられる、共通、保存、異なる構造モチーフが明らかになりました (Ilik et al., 2013)

SRA

ヒトステロイド受容体RNA活性化因子（SRA）は、lncRNAとタンパク質コード転写物の両方をコードする遺伝子に由来する870 nucleotide lncRNAであり、この遺伝子は、SRAが、SNAが、SRAが、SRAが、SRAが、RNAをコードする転写物をコードしている転写物であることを示しています (Ilik et al., 2013). SRAの構造はin vitroでSHAPEとDMSケミカルプロービングを用いて実験的に検討された。並行して、RNase V1による酵素プロービングも行った。その結果、SRAは様々な二次構造を持つ4つの異なるドメインから構成されていることが示された（Novikova et al.、2012）。さらに重要なことは、マウスとヒトの比較構造解析により、RNA構造コアを安定化しつつ、多くの進化的変化が遺伝子座由来のタンパク質に最小限の変異的影響を与えることが強く示唆されたことである（Novikova et al, 2012）。

HOTAIR

細胞外マトリックス沈着とヒト大動脈平滑筋細胞のアポトーシスの制御を通じて散発性胸部動脈瘤と関連する、このlncRNAは心血管において重要な役割を果たす（Guoら、2017）。非末期心不全患者において、HOTAIRは、有意に調節されたlncRNAのパネルの中にありました（Grecoら、2016年）。心筋細胞におけるHOTAIRの保護的役割（Gao et al., 2017）、急性心筋梗塞や先天性心疾患の循環バイオマーカーとしても提案された（Jiang et al., 2018）。 Hotairは2,148ヌクレオチド長であるため、構造決定は極めて困難である。この問題を解決するために、均質で単分散な形態を得るための非変性精製プロトコルが確立されました。 7994>

Braveheart

Braveheart は590ヌクレオチドのlncRNAで、トランスで作用して心血管系形成の制御に関与することが明らかになった。その二次構造はin vitroでSHAPEとDMSプロービングを用いて実験的に評価された。その結果、ブレイブハートは3つのドメインからなる非常に複雑なモジュール構造をしており、12個のヘリックス、8個の末端ループ、5個の大きな内部ループ、5ウェイジャンクションから構成されていることが明らかにされた。興味深いことに、5つの非対称G-rich内部ループ（AGIL）と、高い反応性を示す3末端の55ヌクレオチドストレッチを含んでおり、構造の可能性は低いことが示唆された。この特定の11ヌクレオチド断片の遺伝子欠損は、AGILモチーフが、ジンガタンパク質CNBP/ZNF9との結合を通じてマウス胚性幹細胞から心筋細胞への分化に必須であることを実証しました（Xue et al. そのためには、高度な実験ツール、バイオインフォマティクス、ゲノムエンジニアリングを統合する必要がある。 CRISPR/Cas9遺伝子編集システムは、正確なゲノム位置で標的を定めた改変を行うことができる頑強な技術として登場した。 DNAに二本鎖切断（DSB）を誘発するヌクレアーゼであるCas9は、20ヌクレオチド長の小さな可変配列とアダプター転写RNAからなるRNA分子（sgRNA）によって、プロト隣接モチーフNGGのすぐ近くに誘導されることが可能である。初代細胞ではDSB部位に正確な挿入、欠失、塩基置換を導入でき（Lin et al., 2014）、疾患モデルマウスではin vivoで導入できる（Platt et al., 2014; Abrahimi et al., 2015）。最近、CRISPR/Cas9システムの改良版が、機能的なlncRNAのゲノム規模のスクリーニングに採用されています。このCRISPR干渉アプローチでは、DNAにDSBを誘導する能力がないヌクレアーゼデッドCas9（dCas9）を使用する。抑制ドメイン（例えば、KRAB）（Liuら、2017b）または活性化ドメイン（例えば、VP64）（Konermannら、2015；Besterら、2018）dCas9に融合し、上流制御領域の特定の遺伝子座にsgRNAで誘導してlncRNA転写の抑制または活性化をそれぞれ誘発することが可能である。このようなアプローチは、ハイスループットでlncRNAの機能性をテストするのに非常に有用である

特定のlncRNAが特定されると、lncRNAモジュールと構造ドメインを決定するために、in vivoでlncRNA構造を定義できる技術が重要である。 RNA 構造の決定は、位置の保存と、lncRNA が保存された配列の長いストレッチではなく短い要素に依存する可能性があるという事実を考慮した比較ゲノム解析と組み合わせることができます。 lncRNAの発現を維持しながら、これらの構造ドメインを正確に標的とすることができる遺伝学的研究（Matsumoto et al.、2017）は、これらのモチーフの機能的影響を明らかにする。クローン的に拡大し、構造モチーフの定義された欠失を保有するように操作し、他の細胞型に分化させることができる人工多能性幹細胞におけるCRISPR/Cas9遺伝子編集の使用（Cochraneら、2017；Granataら、2017）により、心血管におけるこれらのドメインの機能的影響の決定的証拠を提供することができる。新規標的としてのこれらの要素の可能性は、治療用途に適した正確な介入のためにさらに探求される可能性がある」

Author Contributions

AZ は研究を開始し、その構造を設計し、原稿を執筆した。 AAが概念的な助言と原稿の修正を行った。 KSはレビューの構造を設計し、概念的な助言を提供し、原稿を修正した。

本研究はBritish Heart Foundationより資金提供を受けた。 AZはBritish Heart FoundationのIntermediate Fellow（FS/13/18/30207）である。

利益相反声明

著者らは、潜在的利益相反と解釈できるいかなる商業または金銭的関係もない状態で研究が行われたことを宣言する。

Abrahimi, P., Chang, W. G., Kluger, M. S., Qyang, Y., Tellides, G., Saltzman, W. M., et al. (2015). CRISPR/Cas9による培養初代ヒト内皮細胞における効率的な遺伝子破壊。 Circ. Res. 117, 121-128. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.117.306290

PubMed Abstract | Cross Ref Full Text | Google Scholar

Arieti, F., Gabus, C., Tambalo, M., Huet, T., Round, A., and Thore, S. (2014). Split Endタンパク質SHARPの結晶構造により、RNA認識モチーフを含むタンパク質に新たな複雑さが加わった。 Nucleic Acids Res. 42, 6742-6752. doi: 10.1093/nar/gku277