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EzColocalization.com（エズコローカライゼーション）。 An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms

EzColocalizationワークフローの概要

EzColocalizationのワークフローは4つのモジュールに分かれ、それぞれがGUI上のタブを持っています。 タブは次のとおりです。 (i) “Inputs “では、画像、マスク、関心領域（ROI）リストの選択と位置合わせを行う。 (ii) “Cell Filters “では、物理的特徴や信号強度に基づいて細胞を選択する。 すべてのモジュールとモジュール内のすべてのプロセスを使用する必要はありません。 いくつかのタブには、全モジュールの選択された全処理を実行する「解析」ボタンの代わりに、特定のモジュールを実行する「プレビュー」ボタンがある。

Inputs

「入力」タブ（図1A）で選ぶ画像ファイルは、以下のものでなくてはならない。 (i) 単色 (すなわち RGB や CMYK 形式ではない) (ii) 8-bit, 16-bit, または 32-bit (iii) 元のピクセル強度値を保持する TIFF のような形式であること. 大きな画像は、ファイル転送のためにZIPやLZWなどのロスレスフォーマットで圧縮し、解析のために解凍することができます。 EzColocalization では、画像に加えて、細胞識別用のマスクや ROI リストを受け付けることができます（下記参照）。 各チャンネルに複数の画像がある場合は、「Stack」メニューで画像をスタックしておくと解析効率が上がります（詳しくは ImageJ のガイドをご参照ください24）。 スタック内の画像は、異なる視野でも時系列でも構いませんが、各チャンネルの寸法、倍率、画像順序が同じである必要があります。 入力タブには、信号強度の閾値を設定するオプションや、異なるチャンネルからのずれた画像を揃えるオプションもあります（図1Bおよび補足情報）。 コロカライゼーション解析に適した画像を取得するための推奨事項は、補足情報に記載されている。 注意：アライメントは、細胞内外のピクセルを区別するために、シグナル強度の適切な閾値を選択できるという前提で動作する。閾値に細胞外の領域や細胞内の限られた領域しか含まれていない場合、アライメントは適切に機能しないことがある。 このため、すべてのアライメントはROIを目視で確認し、適切な細胞領域が選択されていることを確認する必要があります。

EzColocalization は主に1チャンネルの「細胞識別」、2～3チャンネルの「レポーター」画像用に設計されました。 しかし、他の入力の組み合わせでも動作可能である（表S1）。 細胞識別チャンネルは、個々の細胞を識別し、その結果、細胞内と細胞外のピクセルを区別するために使用されます。 細胞識別チャンネルは、光顕画像（位相差25,26や明視野など）、細胞膜や細胞質全体を標識するレポーターを用いた画像（Cy5など、図1B）、細胞の輪郭を描く細胞外色素を用いた画像など、細胞境界を識別できるものであればどのような種類の画像でも可能である。 微分干渉コントラスト（DIC）画像では、閾値法を用いた細胞の自動選択が困難な影ができるため27、DIC画像では、ImageJの「選択ツール」を用いてROIを作成し、手動で細胞領域の輪郭を描き、「マネージャーへ追加」（「編集」メニューの「選択」サブメニュー内）を選択してリストに追加することをお勧めします。 画像内のすべての関心細胞のROIが選択されると、ImageJの「Clear Outside」と「Autothreshold」機能を用いてバイナリマスクが作成できる。

Cell Filters

“Cell Filters” タブは、画像内の細胞の選択（図2A）と細胞内と細胞外のピクセルを区別するために使用されます。 細胞は以下の方法で識別される。 (i) ImageJの閾値アルゴリズム24の一つを選択するか、閾値を手動で選択し（これはInputsタブのドロップダウンリストから「*Manual*」を選択して「Show threshold(s)」ボタンを押すことによって行われる）、細胞識別チャンネルで細胞に対応する領域を識別する（Fig. 2B）、（ii）分水嶺セグメンテーションを使用して細胞識別チャネル画像内の接触オブジェクトを分離する（オプション）（図2B）、（iii）物理パラメータ（図2C）および信号強度（図2D）に基づいて細胞識別チャネル画像からオブジェクトを選択する（図2B）。 EzColocalizationは、入力画像の背景が暗いか明るいかを歪度を用いて自動的に検出しようとします。 背景のピクセル数が細胞のピクセル数よりも多いと仮定すると、歪度が正の画像は背景が暗く、歪度が負の画像は背景が明るいことを示します。 また、「設定」メニューの「パラメータ…」で、入力画像の背景が暗いか明るいかを手動で選択することも可能です。

EzColocalizationは、1つのオプションの「プリウォーターシェッドフィルタ」と8つのオプションのポストウォーターシェッドフィルタ（さらに選択するオプションもあります）を備えています。 ウォーターシェッドセグメンテーションは、分裂している細胞や接触している細胞の分離を助けることができますが28、細胞外物質の凝集体のような大きなオブジェクトを、細胞と同じ大きさの小さな断片に分割することもできます。 後者を避けるために、Pre-watershedフィルターを使用して、大きな面積を持つオブジェクトを解析から除外することができます。 Cell FiltersタブのPreviewボタンを使えば、すべてのフィルタの最小・最大境界を調整したときに、現在の画像上のどのオブジェクトが選択されるかを確認することができます。 流域後セルフィルターには、2つのクラスのパラメーターがあります（表S2）。 (i) 細胞識別チャンネルからの測定値に基づく物理パラメータ、(ii) レポーターチャンネルからの信号強度パラメータ。 物理パラメータはすべてのチャンネルに適用されるが、信号強度パラメータは、それらが選択されたレポーターチャンネルにのみ適用される（レポーターは非常に異なるレベルの信号を持つ可能性があるため）。 ImageJの定義済みオプションに基づくフィルタリングに加え、EzColocalizationには、”MeanBgndRatio” または “MedianBgndRatio” のフィルタがあり、オブジェクト内部のピクセルの平均または中央のシグナル強度を細胞外のピクセルのそれぞれの平均または中央のシグナル強度で割ることによって算出されます。 (i) “heat maps”; (ii) scatterplots; and (iii) “metric matrices” (Fig. 3A).

Heat maps are pseudocolor images that show the relative magnitude of reporter signals (Fig. 3B)． これらは、各細胞、画像、またはスタックにおいて、最小および最大ピクセル値がそれぞれ0および255になるように正規化および再スケーリングすることによって生成される。 ヒートマップの色付けには8つのオプションがあり、各色の強度値は「LUTを表示」機能（ImageJの「画像」メニューの「色」サブメニュー内）から取得することができる。 細胞ヒートマップは、各レポーターが細胞内のどこで最も強く発現しているかを知るのに適している。 画像ヒートマップは、視野内の異なる細胞が実質的に異なる強度を持つかどうかを示すことができ、これは生物学的不均一性またはラベル付けの不均一性を示す可能性があります。 スタックヒートマップは、異なる画像内の細胞が実質的に異なるレベルのシグナル強度を有するかどうかを示すことができ、スライド全体における標識または測定の不均一性（例えば、光退色による）またはシグナルの時間的変化（スタックが時系列である場合）を示す場合があります。 注：ヒートマップの外観は、明るさとコントラストの設定に影響されます。

散布図は、個々の細胞や画像について、2つまたは3つのレポーターチャンネルの信号強度の関係を示しています（図3C）。 この関係は、適切なコロカライゼーションメトリックスを選択する際に重要である（補足情報）。 散布図はまた、局在パターンの不均質性を明らかにすることができる8。このため、バックグラウンドピクセルの除去や異なる細胞タイプに対する個別の解析が必要となる場合がある。

Metric matricは、多くの閾値の組み合わせに対するコロカライズメトリックスの計算値を示すことにより、局在パターンの概要を示すものである。 閾値オーバーラップスコア（TOS）のメトリックマトリクスは、2つのレポーターチャンネルの局在パターンの解析に有用であることが示されている8,15（図3D）。 EzColocalization には、対数スケーリングによる threshold overlap score8, Pearson correlation coefficient (PCC), Manders’ colocalization coefficients (M1 and M2), Spearman’ rank correlation coefficient (SRCC), and intensity correlation quotient (ICQ)8,15 という 5 つの指標を用いて 2 チャンネル分の指標マトリクスを計算するオプションが用意されているため、より完璧に解析できます。 3チャンネルの共焦点は、ICQ、Mandersの共焦点係数、TOS29を使用して測定することもできます（補足情報）

すべてのメトリックの閾値は、信号強度のピクセルのトップパーセンタイル（FT）として測定されます8,15。 例えば、FT=0.1は、信号が最も高いピクセルの10%である。 メトリックマトリックスでは、FTは、閾値の組み合わせのステップサイズを指定するためにも使用されます。 つまり、FT=0.1は、信号の最も大きい画素の10%、20%、…、100%の閾値も選択する。 FTが100に均等に分割されない場合、残りのパーセントが最後のステップサイズとなる。 閾値を必要としないメトリクス（PCC、SRCC、ICQなど）については、閾値以上の画素のみが存在すると仮定して値を計算します。 メトリックマトリックスウィンドウには、結果をテキストまたは画像として保存するオプション、FTまたはメトリックのタイプを変更するオプション、個々のセルのメトリック値をリストとして表示するオプション、および各閾値の組み合わせに対するメトリックの平均、中央値または最頻値を計算するオプションが用意されています。 Proc」（処理済み）と「Raw」ボタンは、それぞれ「List」、「Copy」、「Save…」ボタンで表示、コピー、保存するデータのリストが、各閾値の組み合わせに対するサンプルの平均値（例：中央値）か、すべての閾値の組み合わせに対するサンプルの各セルの全値かを決定します

Analysis

「分析」タブは3つのサブタブ（「分析メトリック」、「メトリック情報」と「カスタム」）を持ちます。 Analysis Metrics」サブタブには、2人のレポーターの共焦点を測定するための6つのメトリクス（図4A）、3人のレポーターのための3つのメトリクス（前項参照）がある。 ユーザーは、PCC、SRCC、ICQについて、閾値を設定するかしないかを選択することができる。 TOSとMandersの共焦点化係数は、計算するために閾値が必要です。 Metrics Info サブタブには、Analysis Metrics サブタブで使用されるメトリクスに関する情報とリソースが含まれています（詳細は補足情報にあります）。 閾値は、Costes の方法30 を使って選択するか、手動で選択することができます。 Customサブタブ（詳細は補足情報参照）では、画像解析のための独自のコードをJavaTMで記述することができます（注：提供されている例はPCCを計算するためのものです）（図4B）。 コンパイル」ボタンを押すと、コードがテストされ、Javaのテンポラリディレクトリに一時ファイルが作成され、コンパイルの結果が「Succeeded」または「Failed」ラベルで表示されます。 成功した場合、コンパイルされたカスタムコードは再びメモリに読み込まれ、選択されたセルに適用される。

すべての解析の出力は、すべてのセルの画像と識別子番号を指定する表（図4C）で、各セルに対して、以下の値が提供される。 (i) 選択された指標、(ii) 物理的パラメータ、および (iii) 各チャンネルの平均信号強度 (選択された場合)。 注：出力表の “NaN “は、値の算出に失敗したことを示す。 また、ユーザーは、サマリーウィンドウ（細胞番号、選択したメトリックの平均値、中央値、標準偏差を含む）（図4D）、メトリック値のヒストグラム（図4E）、バイナリマスク画像、およびROIマネージャの各画像上の各細胞の位置と番号を表すROIのリストを生成することができます。 ROIリストやバイナリマスク画像は、同じ細胞の再解析のために保存することができます。

EzColocalizationの応用

EzColocalizationは、様々な実験や研究者のニーズに合わせた解析のカスタマイズを容易にするために、モジュール方式で使用するよう設計されています。 ここでは、多様な画像セットにおける実問題を解決するためのEzColocalizationの特定のツールのデモンストレーションに焦点を当てています。

EzColocalizationの最初のアプリケーションでは、Cell Image Library (CIL:8773, 8775-8788, Dieter Brandner and Ginger Withersに帰属)からラット海馬ニューロンの画像を用いてデモンストレーションを行っています。 (i) 細胞識別のための非レポーター画像がない場合のレポーターチャンネルの使用 (ii) 細胞を選択するためのセルフィルター (iii) メトリクスを選択するための可視化ツール。 解析のワークフローを図 5A に示す。 1 つは F-actin を標識した画像（ローダミンに結合したファロイジンペプチドを使用）、もう 1 つはチューブリンを標識した画像（Alexa 488 に結合した抗体を使用）です（Fig. 5B）。 F-アクチンとチューブリンの相互作用は、神経細胞の成長と移動に重要である31,32. F-actinはすべての細胞に存在し、細胞の境界を示すことから、我々は細胞の識別にF-actin画像を使用しました8。 F-actin画像から、細胞を識別するための閾値を適用し24、細胞フィルターを用いて細胞の残骸を除去することにより、個々の細胞を選択した（注：図5Aのパラメータ値）

細胞を選択した後、細胞ヒートマップと散布図を用いてレポーター信号の強度を検討した。 その結果、レポーターは高いシグナルレベルでは共焦点化せず、シグナル強度の間に複雑な関係があることがわかった（図5C,D）。 後者のため、MandersのM1、M2およびTOSを用いて局在を定量化した（補足情報）。 図5Bに概略を示した細胞について、Costesの方法で選択した閾値でM1、M2を評価したところ、それぞれ0.289、0.995の値が得られた。 これらの値は、通常、チューブリンがF-アクチンと高い共焦点を持ち、F-アクチンがチューブリンと低い共焦点を持つことを示すと解釈される。 TOS値は、TOS値の中央値でメトリックマトリクスを生成することにより評価した。 このマトリックスは、チューブリンとF-アクチンのシグナル強度の異なる閾値で共局在、反共局在、非共局在を示していた（Fig. 5E）。 F-actinとtubulinが最も高い強度のシグナルを持つ細胞内の部位（各チャンネルのピクセルの上位10%）では、TOS値の中央値は-0.36（n = 20）であった。 この負の値は反局在化を示しており、ヒートマップや散布図から得られる印象や他の報告8と一致する。

2番目のアプリケーションでは、細胞画像ライブラリ33から有糸分裂中のSaccharomyces cerevisiaeの画像を取得し、デモンストレーションを行った。 (i) 手描きの輪郭線による細胞識別（自動化された細胞識別方法が適用できない実験の場合）、(ii) 画像の位置合わせ。 レポーター入力は、紡錘体極本体にTEM1をロードするBFA1タンパク質を持つ野生型株（「コントロール」；CIL：13871）と、BFA1タンパク質を持たない株（∆bfa1欠失変異体；CIL：13870）からの画像であった。 これらのレポーター画像では、細胞はGFPと融合したTEM1タンパク質を発現し、DNAはDAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole)で標識されていた。 TEM1 は有糸分裂中に紡錘体ポールボディに局在し、有糸分裂からの脱出のトリガーに関与している33。 ワークフローを図 6A に示す。 このアプリケーションでは、DIC画像上でImageJの「フリーハンド」選択ツールを用いて、細胞の周りに手動でROIを描いた。 ROIを選択し、ImageJ24の “Clear Outside “および “Auto Threshold “機能を用いて、細胞領域の選択に使用するバイナリーマスクを作成した（図6B）。 この細胞領域は、細胞の識別と、”Default “閾値アルゴリズムを用いたDIC画像とレポーターチャンネル間のアライメント補正に使用した（Fig. 6C）。 この細胞識別と画像の位置合わせの後、前の例で述べたように、画像は可視化と解析の準備ができた。

3番目の応用では、Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC012v1, M14)34 から得た全成虫線虫の画像を用いて、以下のことを実証した。 (i) EzColocalization は生物全体のコロカライゼーションを解析できること、(ii) “cell” filter はレポーターのシグナル強度に基づき個々の生物を選択できること、を実証しました。 この例の画像は、TOS を説明する我々の研究で使用したのと同じデータセットからのものです（ただし、同じ画像ではありません）8。 ワークフローをFig.7Aに示す。 明視野画像にImageJで個々のC. elegansの輪郭を描いてROIを作成し、ROIをROIマネージャに追加して「細胞」の同定を行った。 前腸でclec-60プロモーターから発現するGFPをレポーター1、前腸の隣の器官である咽頭内でmyo-2プロモーターから発現するmCherryをレポーター2としている35。 そもそも線虫にふさわしいと思われるものだけに輪郭が描かれているため、物理パラメータに関するセルフィルターは不要である。 一方、シグナル強度については、トランスジーンサイレンシングの影響によりGFPシグナルが低いC. elegansがいたため、セルフィルターが必要でした36,37 (Fig. 7B)。 その後の可視化と解析は、最初のアプリケーションで説明したように行うことができる。

4番目のアプリケーションでは、3つのレポーターチャンネルに対する共焦点化の解析を実証している。 ワークフローは、「設定」メインメニューで「3 reporter channels」を最初に選択した以外は、2 reporter channelsの場合と同じであった（図8A）。 画像は、Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC025, Version 1, Image set: 37983, image: p23_s9) からU2OS骨癌細胞（n = 66）38の画像を取得した。 3 つのレポーター画像は、DNA、小胞体（ER）、ミトコンドリアをそれぞれ Hoechst 33342、Concanavalin A/Alexa Fluor488 conjugate、および MitoTracker Deep Red で染色した（上段、図 8B）。 細胞の識別は、小麦胚芽アグルチニン（WGA）/Alexa Fluor 555コンジュゲートで標識した細胞膜の画像で行った（図8B上段、左）。 注：この画像にはゴルジ装置とF-actinネットワークも標識されていた38。 細胞膜はImageJの多角形選択ツールを用いてトレースし、個々の細胞のROIを作成し、ROIを含むROIマネージャを選択して細胞の識別を行った。

局在パターンは、以下を除いて2つのレポーターと同じ方法で視覚化された。 (i)レポーターのヒートマップは2つではなく3セットある（下段、図8B）、(ii)散布図とメトリックマトリクスは3次元である（図8C-F）、以外は2人のレポーターと同じ方法で可視化された。 VisualizationタブとAnalysisタブ（Fig. 8G）には、ICQ、TOS、MandersのM1、M2、M3メトリクスを使って3つのレポーターのコロカライゼーションを測定するオプションがある。 3つのメトリクスのうち、TOSが最も解釈しやすいことが分かった。 TOSは3つのレポーターシグナルの共焦点を測定するための単一の値を持ち、核、ミトコンドリア、ERのレポーターシグナルが低閾値で重なり（すなわち、高いFT値で共焦点がある；図8Eの赤色）、高閾値で重ならない（すなわち、低いFT値で反共焦点化がある；図8Eの青色）ことが明確に示されました。 これらの観察結果は、核、ミトコンドリア、小胞体は、既知の物理的相互作用により、その端部（レポーターからの信号が通常低くなるところ）では重なっているが、中心部（レポーターからの信号が通常高くなるところ）では、細胞内の異なる構造であるため重なっていないことと矛盾しない39、40、41)

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