Evolutionary analysis of gyrA gene from Neisseria meningitidis bacterial strains of clonal complex 4821 collected between 1978 and 2016

Evolutionary analysis of 77 gyrA nukeotide sequences from CC4821 N.meningitidis strain

CC4821N.meningitidisの77のde novo gyrA配列は、149の公開されたgyrA配列（追加表1に記載）との関連で解析された。 その結果、226のgyrA塩基配列から近傍結合系統樹が構築された（図1）。 また、最尤法（ML法）でも同様の系統樹が得られた（参考図1）。 塩基配列は有意に分岐しており、全体のp-distanceは0.045であった（Table 1）。 図1

Neisseria 226株のgyrA遺伝子配列の近傍結合系統樹（Neighbor joining phylogenetic tree）。 株名は、種名-GB ID-株ID-ST-CC-セログループ-収集国-収集年-CIP耐性表現型の順で表示した。 欠落している情報は空白で表示される。 例えば、N.meningitidis-AM889136.1-alpha14-ST53-CC53-cnl-Germany-1999 S; Eikenella corrodens-CP034670.1-KCOM3110—–South Korea-2017のようなものである。 CC4821 N.meningitidis株の配列名は赤文字で示した。 本研究で作成した77の配列には下線を付している。 9つの参照株の配列は黒点で示した。 ブートストラップ値＜2990＞70%を示す。 必要な場合は括弧内にブートストラップ値＜7302＞70%を示す。 本研究で同定された9つの遺伝子群を括弧付きの縦線で示す。 CIP抵抗性の表現型は、抵抗性をR、感受性をS、中間抵抗性の表現型をIで示した

解析した226配列中、約62%（140配列）は木の頂点に見つかり、ブートストラップの値は顕著でなかった（図1）。 これらの配列はp-distanceが0.003と非常に均質であった（表1）。 残りの86の配列は、木の頂点にグループ化された配列に対してp-distanceが0.066と、より発散していた。 これらの86の配列に関するノードのほとんどは、ブートストラップ値＜2990＞70％を示した。 さらに、この86個の配列のグループ内でのp-distanceは0.09であり、これらの配列は互いに高度に分岐していることが示された。 また、この86の配列群のp距離は0.09であり、これらの配列は互いに大きく分岐していることがわかった。 これらの9つのグループは、MLツリーにも見いだされた（参考図1）。 グループ1はN.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005とN.subflava-CP031251.1-M18660-2009の2塩基から構成されていた。 このグループはブートストラップ100%で支持され、この2つの配列は他の配列と非常に異なることが示唆された。 これらの配列は7つのアミノ変化を共有していた（表1、追加表2）。 しかし、N.subflava-CP031251.1-M18660—–2009の配列に対応する長い枝は、この配列もN.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-China-2005から著しく分岐し、これらの2配列間のp距離0.06により確認できた（Table 1）

Group 2には、N.meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R、N. meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R、N. meningitidis-KF733178-G1-ST5636-B-China-2011からなる。meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011.

グループ3は1つの配列からなり，N. meningitidis-MK930402-231003-ST12300-CC4821-B-China-2009 である． この配列に対応するノードは、ブートストラップ値80%で支持された。 さらに、この配列と他の解析対象配列とのペアワイズp距離の最小値は0.032であり、この配列は他の解析対象配列と比較して有意に分岐していた（表1）。

グループ5は26配列からなり、主にN. meningitidisからなり、そのうち9配列はCC4821のものであった。 また、ブートストラップ100%で支持された7配列のサブグループには、N.lactamicaの5配列が含まれた。 また、N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009はN.lactamicaと長い分岐を持ち、ブートストラップ100％でクラスターを形成していた。meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-Rとノードを共有するN. cinerea-LS483369.1-NCTC10294 の1配列が含まれていた． しかし、N.cinereaの配列はN.meningitidisの配列と比較して長い枝を持ち、大きな分岐があることが示唆された。 また、グループ6の配列は、CIPに耐性を持つ株であることが示唆された。 しかし，これらの菌株に固有のアミノ酸置換はなく，これらの菌株の耐性表現型に共通のマーカーは存在しないことが示唆された（付表2）． これらの菌株は過去88年間に4大陸の13カ国で収集された。 これらの菌株は、過去88年間に4大陸13カ国で収集されたものであり、地理的な広がりはあるものの、p-distanceは0.003と高い保存性を示していた。 さらに、これらの配列は、基準株053442を含む68のST、24のCC、9のセログループの株から得られたものであった。 GyrA蛋白質内のアミノ酸分岐の解析

GyrA蛋白質内のアミノ酸分岐を129のユニークな配列で解析した（付表2）。 アラインメントで特徴的な931個のアミノ酸のうち、257個の分岐位置が同定された（図2）。 これらの部位はタンパク質全体にわたって見つかっているが、分岐の分布はランダムではないようである。 実際、530位から620位までの2つの領域が高度に保存されており、300位から330位までの領域はより小さな領域であった。 大腸菌のタンパク質によると、最初の領域はアミノ末端ドメインの終点とカルボキシ末端ドメインの始点に相当する。 図2

GyrAタンパク質のアミノ酸分岐は、129のユニークな配列に基づいている。 932アミノ酸のロングアライメント内の位置をX軸に示す。 Y軸（左側）は、特定の乖離位置を持つ配列の割合を示している。 例えば、58%の配列が91番目の位置に変異を持つことを特徴としている。 乖離プロットは、Additional Table 2に示したアミノ酸差表から作成した。 アライメントは10個のギャップを特徴とし、ギャップを特徴とする配列の数を右軸に示し、黒い四角で示した。 比較のため、大腸菌GyrAタンパク質の構造・機能ドメインマップを下段に示しました。 この地図は、以下の文献を参考にして作成しました。 大腸菌とN.meningitidis標準株053442（GB-ID CP000381）のGyrAタンパク質の配列を比較した（追加表4）。 大腸菌の既知のCIP耐性部位を示し、N.meningitidisでは対応する位置を青線で示した。 大腸菌で報告されている8つの耐性部位のうち、N.meningitidisでは83位と87位のみが分岐している（91位と95位）

257の分岐部位のうち、CC4821株のすべての解析対象gyrA配列で共通しているものはなかった。 5箇所（91, 417, 665, 210, 288）は分岐度が高く、129配列のうち40%以上がこれらの位置で変異していた。 例えば、417位は129配列の48%が変異を有していた（図2）。 CIPに感受性のない株はすべてこの位置に変異があり、I、F、Vのいずれかを備えていた（付表2）。

Identification of potential resistance markers to CIP

解析した226の配列中、174がCIPに対する耐性を調べた株のものだった（付表1）。 本研究のために67株が検査された。 前述したように、CIPに感受性のない株（耐性表現型（ツリーではR）または中間表現型（ツリーではI））は、すべて91位に変異があった。 このことは、91位の変異が耐性機構に関係していることを示している。 今回試験した67株のうち、49株は91位に変異があったが、そのうち23株は中間的な耐性表現型であった。 このことは、他の位置が耐性機構に関与している可能性を示唆するものであった。 そこで、さらなる耐性のマーカーとなりうるものを同定するため、226株を対象に各変異位置についてさらに解析を行った。 耐性株（中間耐性表現型を含む）では認められるが、感受性株では全く認められない変化が適格とされた。 しかし、解析の厳密性を高めるために、1株のみで見つかった変異は考慮しないことにした。 合計で33の部位が同定された（追加表3；追加表4の左側）。 例えば、H8Nは18の耐性株（中間表現型2株を含む）で発見されたが、感受性株では発見されなかった。 これら33の部位について、226株すべての解析を行った。 もう一度言うが、解析の厳密性を高めるために、少なくとも1つの感受性株で見つかった変異は破棄されることになる。 したがって、耐性株と感受性株で見つかった変異D95Nは、それ以上検討されなかった。 合計で39の変異（91位のように同じ位置にあるものもある）を解析した（追加表4の左側の緑色の部分）。 少なくとも1つの変異を有する128株について、変異プロファイルを作成した（Additional Table 3）。 その結果、46種類のプロファイルが確認された。つまり、解析した全株の中で、これら39種類の変異の組み合わせは46通りあった（Additional Table 4の右側）。 46 種類の変異プロファイルのうち 16 種類は CC4821 株に関するものであった（Additional Table 4 の赤色の番号）。 また、26のプロファイルはCIP耐性であることが知られている株（Additional Table 4の青文字の株名）に関するものであった。 39の耐性マーカー候補のうち、変異N103DとT91Iはプロファイルで最も共有されており、それぞれ29と27の出現があった。 しかし、H8N、I111V、E793Q、A679Sはそれぞれ23、21、18、17回出現しており、他の変異もよく知られていることは注目に値する。 また、耐性株の45％（128株中58株）が変異T91Iのみを有していたことも特筆される。 耐性マーカーは当初大腸菌で報告されていたため、大腸菌の配列におけるこれらのマーカーの位置を確認するために、大腸菌と基準株N.meningitidis 53,442のgyrA配列を比較する必要があった（付表5）

N. spp間のgyrA遺伝子内の組み換え

系統解析から組み換え候補の存在を確認することができた。 例えば、グループ1では、N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005とN.subflava-CP031251.1-M18660について特に注目された。 この2つの配列は、他の株には見られない7つの残基の変化を共有していた。 さらに、このうち5つの変化は30アミノ酸以内に見られた（表1）。 また、740位と750位のように、一方の株で見られたアミノ酸の変化が他方の株では見られないこともあった。 これらの観察結果は、2つの菌株間の組換えを示唆しており、BootScan解析により確認された(Fig. 3a)。 また、他の3つの組換え候補もBootScanで確認された。 図3bは、CC4821株（N.meningitidis-MK930428-421615-ST10235-CC4821-B-China-2016 または N.meningitidis-CP000381.1-053442-ST4821-CC4821-C-C China-2004_R ）と N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294 —–との間の組み換えを記述している。 図3cは、N.lactamica-CP031253.1-M17106—–とN.meningitidis-KJ415206.1-54-R6—–、N.meningitidis-CP000381.1-53，442-ST4821-SCC4821-C-China-2004_Rの2株間で複数の組み換え事象が起きていることを特徴としている。 最後に、N.meningitidis株間の組換えを図3dに示した。 図3

Neisseria の種間・種内組換えの可能性 a. N.subflava と N.meningitidis 間の組換え． N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 をクエリーとしてSimPlotでBootScanプロットを作成した。 b. N.cinerea と N.meningitidis 間の組換え。 N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R をクエリーとして、SimPlotでBootScanプロットを作成した。 N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 をクエリーとした BootScan プロットが SimPlot で作成された。 N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011 をクエリーとし、SimPlot で BootScan プロットを作成した。 組換え過程で最も貢献すると予測される株（バックボーン）を赤線で示す。 N.meningitidis reference strain 053442 (GB ID CP000381)を黒線で示す。 図2

に示した大腸菌の機能マップをもとに、参照株053442の機能マップを上に示した。