Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation (ERAD)

2.1 タンパク質のフォールディング過程とミスフォールドしたタンパク質の認識

細胞内のタンパク質全体の約30%、すべての膜貫通タンパク質はERで合成され、Sec61チャネルを介して分泌経路への入り口として機能している …… 。 分泌経路に移行する際、新たに合成されたタンパク質のN末端疎水性シグナル配列は、ペプチダーゼ複合体によって切断される。 ERの酸化的環境は、ジスルフィド結合の形成を助け、タンパク質の三次構造を安定化し、タンパク質の集合を促進する。 フォールディングの過程で、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）がシステイン残基上の遊離チオールの対を酸化することによって、ジスルフィド結合が形成される。 PDIはサイクルとして働き、最初の酸化の後、PDIとチオール酸化還元酵素であるERp57によってジスルフィド結合が異性化され、タンパク質の正しいフォールディングを安定化させることがある。 逆に、ERADのレトロトランスロケーションのステップでは、ミスフォールドしたタンパク質のジスルフィド結合の還元が必要である。 実際、PDIはシミアンウイルス40（SV-40）やコレラ毒素のレトロトランスロケーションを可能にしている。 ER酸化還元酵素であるERdj5は、ジスルフィド結合を減らし、EDEM (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein) と相互作用し、SV-40のレトロトランスレーションのステップを加速している。 ERDJ5はまた、病気の原因となるα1-アンチトリプシン変異体（null Hong Kong）の分解を制御する。

折り畳みは、分子シャペロンによってミスフォールディングとアンフォールディングに対して補助される。 シャペロン様糖鎖は、タンパク質のフォールディングと分解に重要な役割を果たすN-グリカンに結合する。 このように、糖鎖付加とタンパク質フォールディングの品質管理、そしてERADは、機能的に密接に関連していることが明らかになっている。 ERに入った後、新たに合成されたポリペプチド鎖の大部分はN-結合型糖鎖に覆われている。 オリゴ糖転移酵素は、新生タンパク質分子の大部分にあるAsn-X-Ser/Thrコンセンサス配列を認識し、ER膜に局在するドリコールから高マンノース含有コア糖鎖グループ（Glc3Man9GlcNAc2）をタンパク質に共有結合させる。 タンパク質に結合した糖鎖の半減期が非常に短いため、グルコシダーゼを介した前駆体糖鎖基の転移後、直ちに糖鎖プロセッシングが開始される。 3つのグルコース残基のうち2つが切断された後、新生タンパク質はCNXやCLRのような品質管理レクチンと相互作用することが可能である。 この相互作用は、残りのグルコース残基が切断されるまで維持される。 CNX/CLRサイクルから糖タンパク質が解放された後、最後のグルコースも切断され、グリコシル化されていない基質が作られる。 このため、基質とレクチンシャペロンとの相互作用が損なわれる。 この段階で、タンパク質が適切に折り畳まれていれば、ERから最終目的地へと向かうことができる。 しかし、糖タンパク質がまだアンフォールドしている場合、ERに留まり、UDP-グルコース：糖タンパク質グルコース転移酵素によって再グルコース化され、CNXとCLRにリバウンドし、タンパク質が適切にフォールドする時間を与える。 再グリコシル化／脱グリコシル化のサイクルの終了に関与するメカニズムはまだ解明されていない。 しかし、ポリペプチド鎖が繰り返しフォールディングを試みても成熟型にならない場合、コア糖鎖の末端マンノース残基はER α1,2-マンノシダーゼI (ERMan1) によって徐々に除去されることは明らかである。 ERMan1は、N型糖鎖の中間枝からマンノース残基を除去してMan8GlcNAc2アイソマーを生成する。 このトリミングにより、糖タンパク質はレジルコシル化およびCNXサイクルからの脱却のための劣った基質となる。

適切に折り畳まれたタンパク質の疎水性パッチは、通常可溶性タンパク質の内部に埋もれている。 しかし、折り畳みの失敗したタンパク質では、これらのパッチが露出している可能性がある。 もし、タンパク質が露出した疎水面を持つ場合、BiPはその表面に結合し、凝集を防ぐことによって、適切なフォールディングを試みるためにこれらの凝集しやすい面を隠すことができる。 しかし、フォールディングが成功しなかったり、遅れたりすると、シャペロンとミスフォールディングタンパク質の相互作用が拡大し、タンパク質が他のシャペロンやERADプロセスへ移行する高度なプロセスが行われるようになる。 1999年には、酵母のERAD基質が、ER内腔のHsp70であるBiPの必要性が著しく異なることが明らかにされた。 pαFや液胞プロテアーゼCPY*の変異体などの可溶性基質の分解はBiPに依存するが、膜貫通タンパク質Pdr5*p, Ste6-166p, Sec61-2p, Hmg2pの分解はBiP非依存的に起こることが明らかになった。 2004年には、Ste6-166pのような細胞質ドメインを持つ基質はBiP非依存的に分解されるが、内腔に欠陥のあるタンパク質はBiPを必要とすることが示され、ミスフォールド病変のトポロジーに応じて（ER lumen, ER membrane, cytoplasm）細胞質または内腔シャペロンが認識と分解の標的化に機能していると考えられる

ERAD中の基質認識については、モデルミスフォールドタンパク質を用いて調べることが可能である。 このマンノースのトリミングを阻害すると、ミスフォールドした糖タンパク質がER内で安定化することから、脱マンノース化がミスフォールドした糖タンパク質の分解に必要であることが明らかになった。 ERMan1を過剰発現させると、N-グリコシル化タンパク質の分解が促進される。 このトリミングにより生じたMan8-GlcNAc2含有糖タンパク質は、ERのマンノシダーゼ関連レクチンであるEDEM1 (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein 1, Htm1p in yeast) の基質となる。 さらに、ミスフォールドした糖タンパク質はERManIやEDEM1と相互作用してERADされることが提唱され、レクチン-糖鎖相互作用がEDEM基質認識に重要であることが明らかになった。 ERMan1はミスフォールドタンパク質のERADを開始する生物学的タイマーであることが示唆されていたが、最近の研究により、特に非基底条件下では、マンノシダーゼがERAD中の激しい脱マンノシル化に単独で関与していないことが明らかにされた。 ERストレス（unfolded protein response active）条件下では、EDEM1の転写上昇がERMan1のタンパク質分解によるダウンレギュレーションを抑制し、ERAD効率を向上させる。 EDEMは基質の脱マンノース化にも重要な役割を担っているようである． EDEM1もまた、いくつかのERAD基質のレジルコシル化を阻害し、レトロトランスロケーションと分解を促進する . 一方、Htm1pのマンノシダーゼ・ホモロジー・ドメイン（MHD）は基質結合に必要であるが、哺乳類のEDEM1はMHDドメインとは無関係にミスフォールドしたタンパク質と結合することから、EDEM1の基質結合にはマンノースのトリミングやグリコシル化さえ必要ない可能性が考えられる . このように、EDEM1は糖タンパク質のN-結合型オリゴ糖に加え、ミスフォールドタンパク質のフォールディング損傷も認識することが可能である。 つまり、EDEMは直接または間接的に糖タンパク質の脱マンノース化に関与している、あるいはマンノースでトリミングされたタンパク質に結合してERADの標的となる受容体として機能している（図1）

C枝から末端マンノースを切断すると、OS9（酵母のYos9）やXTP3-BなどのERADレクチンに対する認識シグナルとして機能するα末端α1，6結合マンノース残基が露出します(図2)。 両者はマンノース6リン酸受容体ホモロジー（MRH）ドメインを介して、主にα1,6結合のマンノースjを認識する。さらにOS-9はα1,6結合のマンノースeとcも認識する。

Hrd1複合体をモデルとしたERADの模式図。

基質認識と標的化に必要な因子（EDEMs、OS9、XTP3-B）は超分子複合体中に存在する、あるいは重要なERADレギュレーターと相互作用するといういくつかの報告があります。 例えば、EDEM1はCNXと相互作用し、CNXサイクルから基質を受け取り、NHK-α1-アンチトリプシン変異体のようなERAD基質の分解を促進する。 また、EDEM1はERのレトロトランスロケーション機構の構成要素とも結合している。 EDEM1はミスフォールドしたタンパク質と結合し、そのMHDドメインを用いて異常なタンパク質をHrd1-SEL1Lユビキチンリガーゼ複合体のER常在糖タンパク質SEL1Lタンパク質に標的化していることが示唆されている。 SEL1Lは、いくつかの内腔基性認識因子を足場にして、それらをHrd1に結びつけている。 OS9とXTP3-BもHrd1-SEL1L複合体に結合し、その複合体にはBiPとGRP94も含まれている。 さらに、XTP3-BはBiPとHrd1複合体を結びつけていることが提唱されている . 仮説によると、これら3つのシャペロン（EDEM1、OS9、XTP3-B）はオリゴマーとして機能し、1つのモノマーは基質と、もう1つはHrd1-SEL1L複合体と相互作用している。 さらに、EDEM1はトランスロコンの候補である膜貫通タンパク質Derlinと相互作用する。さらに、Derlin2はEDEM1と細胞質AAA-ATPase p97との相互作用を増強することが示されており、ATP加水分解とミスフォールドしたタンパク質のレトロトランスロケーションを結びつけている

ERADにおける基板認識ステップは、異なるが協調した役割をもついくつかの異なる酵素やシャペロンの関与によって複雑化することが明らかであった。 さらに、基質によって、関与するタンパク質の数や特徴も異なる。 例えば、ミスフォールドしたタンパク質の分解には、EDEM、ERdj5、BiPの協調的な役割が示唆されている。 CNX-CLRサイクル終了後、EDEM1はMan8-GlcNAc2糖鎖構造をさらにトリミングし、ERdj5はジスルフェート結合を減少させる。 同時に、ERdj5はBiPのATPase活性を活性化する。 ADP結合したBiPはミスフォールドしたタンパク質に結合し、retrotranslocation complexに移行するまでretrotranslocation componentの形で保持する。

ERADは非糖化タンパク質の品質管理にも関わっており、これはレクチン様タンパク質とは無関係である。 ERADの基質である非糖化タンパク質である免疫グロブリン軽鎖（Ig-K-LC）は、BiP依存的に分解される。 奥田・清水とHendershotは、この非糖化BiP基質のERAD経路を明らかにし、この過程に関与すると考えられる様々なタンパク質相互作用のダイナミクスを明らかにした。 Ig-K-LCは分子内に2つのジスルフィド結合を持ち、完全に酸化された状態では小胞体から細胞質へ移行することができない。 BiPは部分的に酸化されたIgと相互作用し、Ig-K-LCの完全な酸化を防ぎ、その結果、ERからの放出を促進する。 さらに、膜貫通型UBLドメイン含有タンパク質であるhomoCys-responsive ER-resident protein (HERP) が、糖鎖を持たないBiP基質の受容体として関与していることが示唆されている … HERPはDerlin1と相互作用し、部分酸化されたIg-K-LCはBiPからHERP-Derlin1-Hrd1複合体に移行し、その後、プロテアソーム分解に導かれる … 続きを読む BiPの他に、ジスルフィド還元酵素としてのERdj5も、非糖化タンパク質のERADに重要であることが指摘されている。 BiPによって捕捉された非糖鎖基質は、ERdj5に転送され、ジスルフィド結合が切断される。 そして、これらの基質はBiPの助けを借りてSEL1Lに転送され、レトロトランスロケーションが行われる。 BiPの他にもOS9やXTP3-Bが非糖化タンパク質のERADに関与していることが知られている

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