Echovirus 4 associated to hand, foot and mouth disease

VIROLOGY

Echovirus 4 associatedado à doença de mão, pé e boca

Denise Hage Russo; Adriana Luchs; Bráulio Caetano Machado; Rita de Cássia Carmona.All rights reserved.Copyright © 2008-2013 Japan Certification Services NV; Maria do Carmo Sampaio Timenetsky

Enteric Viruses Laboratory, Adolfo Lutz Institute, São Paulo, SP, Brazil

Summary

手足口病 (HFMD) は主に子供に発症し、小水疱形成性発疹およびびらん性口内炎を特徴とする伝染性腸管ウイルス感染症である． エコーウイルス4（EV-4）は、無菌性髄膜炎とよく関連している。 HFMDとEV-4との関連はこれまで報告されていない。 Adolfo Lutz Institute腸管ウイルス研究所に，微熱，口内炎，手掌・足底に水疱を伴う発疹を呈した14ヵ月児の2検体を送付した． 臨床検体を3種類の細胞株に接種し，細胞毒性（CPE）を示した検体を間接免疫蛍光法（IFA）およびone step RT-PCRに供した． RT-PCR産物をアガロースゲル電気泳動したところ、エンテロウイルス群に特徴的な437bpの産物が検出された。 IFAによりエコーウイルス4型が同定された． HFMDは主にエンテロウイルス71（HEV-71）とコクサッキーウイルスA16（CV-A16）が関与するウイルス感染症であるが、今回の結果はHFMDに関連する血清型の多様性を示し、この疾患およびその合併症に対する疫学調査の重要性を強調している。

キーワード 手足口病; エンテロウイルス; エコーウイルス

RESUMO

手足口病（DMPB）は主に小児に発症し、手のひらサイズの水泡性発疹と口内炎を特徴とする伝染性エンテロウイルス感染症である． エコーウイルス4（EV-4）は、無症候性髄膜炎によく関連しています。 EV-4によるDMPBの会合については、これまで記載されていない。 発熱、咽頭分泌物、手足の発疹を呈した14カ月児の2検体がInstituto Adolfo Lutzの腸管ウイルス研究室に送られました。 サンプルは3つの異なる細胞株に接種され、細胞毒性（CPE）を示したものは、間接免疫蛍光法（IFI）と「ワンステップ」RT-PCRに供された。 PCR産物をアガロースゲル電気泳動したところ、エンテロウイルス群に特徴的な437pbの産物が検出された。 IFIにより血清型EV-4が同定された。 DMPBは主にエンテロウイルス71（HEV-71）やコクサッキーウイルスA16（CV-A16）が関与するウイルス感染症であるが、今回の結果はDMPBの原因菌としてEV-4をターゲットにした疫学的・実験的研究の必要性を強調するものであった。

はじめに

手足口病（HFMD）は、発熱、口の中のただれ、水疱を伴う発疹を特徴とする、幼児および10歳未満の子供によく見られる病気です。 HFMDは、微熱、食欲不振、倦怠感、そしてしばしば咽頭痛で始まります。 1〜2日後、発熱と口の中のただれの発生が確認されます。 水疱を伴う小さな赤い斑点が現れ、それが潰瘍となるのが一般的です。 通常、舌、歯ぐき、頬の内側にできます。 皮疹は1-2日かけて、平坦または隆起した赤色の斑点ができ、一部は水疱を伴います。 発疹はかゆみを伴わず、通常、手のひらと足の裏にできます。 また、臀部にも現れます。 ただし、HFMDの患者さんの中には、発疹や口内炎だけの方もいらっしゃいます4。

感染経路は、鼻や喉の分泌物との直接の接触、または糞便の経口摂取によって人から人へ伝染します。 ペットや他の動物への感染や、ペットからHFMDに感染することはない。 HFMDは世界各地で発生し、夏から初秋にかけて多く見られます4。 母体から胎児への垂直感染も起こりますが、長期的な合併症を伴わずに治癒する場合もあれば、第一期の感染で自然流産や子宮内発育遅延を引き起こす場合もあります。 その他、心筋炎、髄膜脳炎、肺水腫などの合併症が報告されており、死亡例もあります16。

最初のHFMDの報告は1958年にROBINSON & RHODESによって行われた12。 彼らは、1957年6月と7月にカナダのトロントで60人以上に見られた、発熱と口腔内病変を伴う異変を報告した。 27検体のうち3分の2の便からCoxsackievirus A16 (CV-A16) が分離された。 次に報告されたコクサッキーウイルスの流行は、1960年の夏にイギリスのバーミンガムで発生し、ALSOPら2名によって記述された。彼らは、手足の小水疱と口腔咽頭病変に注目し、この発疹を手足口病16と命名している。

HFMDはピコルナウイルス科のエンテロウイルス（一本鎖RNA、非包囲型）によって引き起こされ、CV-A16またはエンテロウイルス71（HEV-71）に最も多く関連しています。 CV-A4〜CV-A7、CV-A9、CV-A10、CV-B1〜B3、CV-B5に関連する散発事例も報告されています。 感染症は通常散発的ですが、定期的に流行が起こります。 初感染は頬粘膜と回腸粘膜で、その後24時間以内に所属リンパ節に転移する。 その後、急速にウイルス血症が進行し、口腔粘膜や皮膚にウイルスが広がります。 感染後7日目くらいから血清抗体価が上昇し始めることがあります6,8。

対象者および方法

対象者 2003年7月にサンパウロ市内のデイケアセンターでHFMDが発生し、14ヶ月の男児で本症が疑われた2検体がAdolfo Lutz InstituteのEnteric Viruses Laboratoryに送られた。 発熱、口内炎、倦怠感、食欲不振、手のひらと足の裏の発疹を呈していた。 同センターの他の8人の子供（10カ月から3歳まで）も同様の症状を呈した。 HFMDは他の医療機関でも診断されていた（私信）． 血清学的検査を抗体価測定に進めるために、対になる血清試料を採取することは不可能であった。

ウイルスの分離と同定。 ラップ後6日以内に採取したサンプルは、4℃で10,000 x g/60分の遠心分離下で清澄化し、抗生物質（ストレプトマイシンおよびペニシリン）を加えて上清を-70℃で保存し、3種類の細胞株に接種（0.1および0.2 mL/tube）した。 RD（ヒト横紋筋肉腫）、HEp 2（ヒト喉頭癌表皮）、Vero（緑色サル腎臓）の3種類の細胞株に最小必須培地（それぞれイーグルL15、イーグル＋AANE＋piruvate、199培地）入りで接種（0.1および0.2 mL/チューブ）するまで保存した。 その後、チューブを35-37ºCに保った。 培養物を毎日倒立顕微鏡で観察し、細胞毒性（CPE）を観察した。 HEV感染に特徴的なCPEが出現するか否かまで、接種した材料を継代した7。

Indirect Immunofluorescence Assay – IFA: 細胞培養物が少なくとも75%のCPEを呈したとき、それをチューブから掻き取り、細胞懸濁液をスライドグラスにスポットし、風乾し、アセトンで固定した。 次に，属，群，HEV血清型に対する市販の特異的モノクローナル抗体（Chemicon International Inc.，Temecula，CA/USA）を用いて間接免疫蛍光測定（IFA）に供した． スライドウェルを落射蛍光顕微鏡で観察した3。

RT-PCR: Trizol® LS (Invitrogen, cat. 1296-010) とクロロホルムにより，製造元の指示に従い，分離ウイルスからウイルスRNAを抽出した． 12,000 xgで遠心分離後、水相を分離し、イソプロピルアルコールで沈殿させた。 RNAペレットは75%エタノールで洗浄した。 RNAsinを添加し、RNAを-70 ºCで保存した。 抽出したRNAと混合物を用いてcDNAを合成した。 50 mM MgCl2; 10x PCR buffer; 1.25 nM dNTP; 20 µM/µL primer AS1/S1; 2 µL Super Script II RNAse Reverse Transcriptase; 2.5 U/µL TaqQ DNA Polymerase; 40 U/µL RNAsin and Milli-Q water. 増幅反応は、Gene Amp PCR System 9600 Perkin Elmerサーモサイクラーを用い、以下のプログラミングで実施した。 (42ºC/1h) + (95ºC/5min) + 25 cycles (94ºC/1min + 50ºC/2min + 72ºC/1min) + (72ºC/7min) のサイクルで行った。 PCR産物は1.5%アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイドで染色し、UV光で可視化した。 5’非翻訳領域に向けたプライマーは437bp13の産物を増幅した。

RESULTS

HEVを示唆するCPE：丸み、縮み、核ピクノーシス、屈折、細胞変性はRDとVero細胞に感受性があった。 陽性培養の報告までの期間は4-7日程度であった。

落射蛍光顕微鏡で細胞の核および/または細胞質に明るいアップルグリーンの蛍光が400倍で観察でき、エコーウイルス4血清型に陽性反応を示した。 IFAでは、他のモノクローナル抗体には陰性であった。

RT-PCRでHEV属を確認した． アガロースゲル電気泳動で437bpの産物を認め，HEVと同定された（図1）．

DISCUSSION

今回同定された病因は，これまでHFMDに関連していた他のものとは異なるHEVであった． 本症はCV-A16やHEV-71との関連が指摘されているが，EV-4とHFMDとの関連については文献上，疫学的なデータはなかった．

一方、マレーシアで発生したHFMD（1997年）は、EV-1、CV-A9、HEV-711に関連していた。 HEV-71によるHFMDはマレーシア（1997年）と台湾（1998年）のアウトブレイクで脳炎の死亡例と関連している17。 2000年後半にはCV-A16，EV-7に加え，EV-7もHFMDの病因となることが明らかになった5． ブラジルではMOREIRAら（1995）がCoxsackievirus B3（CV-B3）に関連した流行性外来疾患を報告している10． ブラジルではEV-4とHFMDの関連は報告されていないが、これは臨床的に疑われなかったためと思われる。

EV-4は一般に無菌性髄膜炎、脳炎、麻痺、Guillan-Barré症候群、発疹、呼吸器疾患と関連があり、主に無菌性髄膜炎の集団発生の原因として世界中で発見されています。 1972年から1999年にキューバで、1981年から1989年に南アフリカのケープタウンで、1997年4月にイスラエルとパレスチナ自治区の地域で、1988年から2003年にスペインで、1982年秋にポーランドで、2002年にインドのVelloreとその周辺地域で発生しました8,9,11,14,15,18.

通常、エンテロウイルス感染症は無症状か軽症で終わります。 そのため、血清検体を採取して、微量中和法による抗体価測定を行い、分離されたウイルスが病気の原因であることを確認することが推奨されます。 便の分離に伴い、血清の抗体価が4倍に上昇（セロコンバージョン）すれば、急性感染症であることが確認される。 残念ながら、本研究では血清の採取ができなかった。

この結果は、EV-4が病気の原因であると言い切るには十分ではないが、シグナルと明らかな臨床症状は、ウイルスが通過性のウイルスではないという仮説を裏付けると結論付けるのは妥当であると思われる。

HFMDの主な原因として知られているCV-A16とHEV-71は、通常RD、HEp2、Vero細胞培養でCPEを生成するが、本研究では同定されなかったことを強調することが重要である。

今回の研究でEV-4がHFMDの原因菌であることが示されたが，いずれは他のHEV血清型もHFMD症例に関連する可能性があることが示唆された． この症例報告は、この血清型に関する疫学的および実験的研究を強化する必要性を強調し、HFMDに関与する他のHEV血清型の監視をブラジルにおいて強化する必要があることを示す。

1. このような状況下で、「手足口病」「口蹄疫」等の感染症が発生し、その対策として「手足口病」「口蹄疫」「口蹄疫」「口蹄疫」「口蹄疫」「口蹄疫」「口蹄疫」「口蹄疫」「口蹄疫」「口蹄疫」「口蹄疫」「口蹄疫」「口蹄疫」等の感染症が発生した。 Scand. J. infect. Dis., 31: 331-335, 1999.

2. また，”手足口病 “は1959年にバーミンガムで発生したものであり，”手足口病 “と “口蹄疫 “の2種類がある． Brit. med. J., 5214: 1708-1711, 1960.

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5. また、このような事態を回避するために、「災 害の芽」を摘み取ることも重要である。 J. gen. を用いた。

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8. このような状況下において、「無菌性髄膜炎の大規模な発生に関連したエコーウイルス4の新しい変種」。 J. clin. Virol., 13: 29-36, 1999.

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17. また，このような感染症が発生した場合，どのように対処すればよいのでしょうか？ 日本. J. infect. Jap. J. infect.

18. また、このような状況下において、「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」。 エコーウイルス11の循環は、スペインで過去数年間 – コントロールカリダッドSEIMC、2004年。 (http://seimc.org/control/revi_viro/echo11.htmで入手可能). 2005年5月にアクセス

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