ChIP off the old block: クロマチン免疫沈降法

何がどこでDNAに結合しているかを評価するために、クラシックメソッド-クロマチン免疫沈降（ChIP）から多数の技術が構築されています。 新しい技術では、サンプルのサイズを小さくしたり、DNAと結合したタンパク質複合体を調べたり、関与するヌクレオチドをより詳細に評価することができる。 分子生物学において最も広く使用されている技術の1つであるクロマチン免疫沈降法は、30年以上前に発明されましたが、それについて変わったものもあれば、変わらないものもあります。 DNAと相互作用するタンパク質を抗体で免疫沈降させ、熱で架橋を元に戻し、関連するDNAを分析するのである。 その後、この技術をディープシーケンスと連携させ、ゲノムスケールでタンパク質とDNAの相互作用を調べるChIP-seq技術を開発した。

ChIPは、転写因子がどのように作用するか、ヒストンがどのように遺伝子発現を調節するか、また、生物発生や疾病に影響を及ぼすその他の基本的な問題を扱うために利用されてきました。 9 月には、C. David Allis と Michael Grunstein が、ヒストンに関する研究-ChIP に依存した研究-で権威ある Lasker 賞を受賞しています。 また、ChIP-seqは現在、ENCODE（ENCyclopedia Of DNA Elements）プロジェクトの基礎となっており、様々な細胞種におけるゲノムの制御領域をマッピングする取り組みを行っています。

これらの技術はすべて、ChIP-seqだけではできないこと、あるいはうまくいかないことを行うことを目的としています。 そして、どの分子も基本的な目標は同じであり、どの分子がどこでDNAと結びついているかを見つけることです。

「私たちは、単一細胞における単一分子の相互作用を系統的に直接評価する、正確で決定論的な方法を考え出す必要があります」。

Making it work

「ダークアートと呼ぶのは言い過ぎです」と、イスラエルのエルサレム・ヘブライ大学のコンピューター科学と生物学の教授、Nir Friedmanは言っています。 しかし、よく使われる手法であるにもかかわらず、「実験を較正するほど忍耐強い人はほとんどいない」と彼は言います。

ChIP-seq実験は多くのノイズを発生させると、フリードマン氏は指摘します。 ホルムアルデヒドは無関係の分子を架橋し、抗体は非標的タンパク質を引き落とし、DNAを分解する最も一般的な方法である超音波処理は、開いたコンフォメーションのDNAを分解する傾向があるのです。 フリードマンによれば、「最終的に配列決定したり、見たりするものの半分以上は、非特異的結合である可能性がある」のだそうです。

ENCODEは、抗体の品質を評価し、無意味なデータを選別するためのガイドラインを公表していると、フリードマン氏は指摘する。 このプロジェクトでは、たとえば、データをコントロールに正規化したり、「ピーク」やDNA結合の可能性がある領域を特定したりするために使用する、最新の計算ツールへのアクセスも提供しています。 Keoghは、ヒストン研究によく用いられる多くの抗体が、ChIPでは標的外のエピトープに結合するなどして、うまく機能しないことを示した最近の研究に携わっている。 また、この研究では、ENCODEガイドラインを超える検証ステップを提案しています。

研究者の中には、CETCh-seq (CRISPR epitope tagging ChIP-seq) のように、ターゲットにエピトープタグを組み込むことによって、抗体の問題を回避する人もいます。 長年にわたる技術であるDamID (DNA adenine methyltransferase identification)は、隣接するDNAに分子マークを付けるような因子を工学的に作り出すものである。

他の研究者は、カリフォルニア大学サンディエゴ校医学部のAlon Goren氏のグループのように、基本的なChIP技術をまだ改良しており、ChIP-seqの完全自動化を実現しています。 Goren氏によると、最適な抗体濃度は抗体や細胞の種類によって大きく異なり、逆架橋などのいくつかのステップは不要であるという。 また、Goren研究室は、ポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体の方が優位であることも示している。

しかし、完全に最適化されても、ChIP-seqは基本的にまだ制限されています。 たとえば、一般に、転写因子を評価するには10万個以上の細胞、ヒストン蛋白質を評価するには1万個以上の細胞を必要とすると、Goren 氏は述べています。 また、ほとんどの場合、この方法は、一度に1つのタンパク質、1つの抗体を調べるためのものである。

タンパク質複合体を把握する

複合体を調べる1つのアプローチは、RIME (Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins) やChIP-MSなどの方法を使用して、ChIP-seqと質量分析 (MS) とを組み合わせることです。

ただし、これらの方法の欠点の1つは、DNAと関連付けられていないタンパク質も免疫沈降によって引き下げられる可能性があることだと、ペンシルベニア大学（フィラデルフィア）の分子生物学者、David Stegerは述べています。 その代わり、「誰もが開発しようとしているのは、特定のエンハンサーにおける遺伝子座特異的プロテオミクスです」とStegerは言います。

クロマチン結合複合体を評価するための新しい技術の1つは、ドイツ・ハイデルベルグのドイツ癌研究センターのJeroen Krijgsveldのチームと彼の同僚によって開発されたChIP-SICAP (selective isolation of chromatin-associated proteins) である。 この技術は、抗体と結合したDNAにビオチンのタグを付け、ビオチン結合ストレプトアビジンビーズで引き下げてから質量分析するものである。

Steger教授は、間葉系幹細胞から脂肪細胞への移行を促進するエンハンサーに結合したタンパク質を調べるために、ChIP-SICAPを適用しています。 Steger氏は、「私たちがやろうとしているのは、エンハンサー・プロテオームを特定することです」と述べています。

他のアプローチは、特定のDNA配列に狙いを定めたガイドRNAを認識するCas9を含む遺伝子編集システムを利用するものである。 研究者たちは、Cas9にビオチンや、近傍のタンパク質のビオチンラベル化を促進する酵素でタグ付けし、MSで分析した結果、ビオチンラベル化されたタンパク質を発見しました。 このアプローチは、離れたゲノム要素間の相互作用を明らかにするためにも展開されている。 このような方法は、Hi-C、ChIA-PET（Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag sequencing）、HiChIPなどのゲノムの3次元構造を評価できるChIP-seq関連手法や、SPRITE (Split-Pool Recognition of Interactions by Tag Extension) などより最近の方法のレパートリーを広げる可能性があります。

DNAと結合した複合体を評価するこれらの新しい手法は、生物学者による遺伝子制御の見方を鮮明にすることが期待されます。 しかし、MSを利用する場合、MSは存在量の少ないタンパク質を容易に検出できないという制限に直面すると、Steger氏は指摘する。 さらに、新しい技術のすべてが、専門家でなくても利用できるものばかりではない。

いくつかの企業は、RIMEやChIP-seqなど、より確立された技術をアウトソーシングするサービスを提供しています。 ChiP-seqおよび関連サービスを提供する企業には、カリフォルニア州カールスバッドのActive Motif、ベルギーのリエージュとニュージャージー州デンビルのDiagenode、および北京のNovogeneがあります。 これらの企業や他の企業もChIP-seqのキットやコンポーネントを提供しているが、多くのラボは独自に試薬を作成している。 Keoghはまた、自社での研究は、最適化ステップをよりよくコントロールできることを意味すると述べている。

ChIP実験中の実験パラメータに注意することは、それ自体でデータの質を高めることができると、マサチューセッツ州ボストンのダナファーバーがん研究所およびハーバード大学医学部でいくつかの大型高分子タンパク質複合体を研究しているCigall Kadoch教授は述べています。

Kadochは、タンパク質同士やDNAを架橋するために使用するホルムアルデヒドの濃度を、抗体や細胞の種類ごとに最適化するように注意しています。 抗体を選択する際には、エピトープが表面でアクセス可能で、したがって免疫沈降が可能であると予測されるかどうかに留意している。 また、完全に組み立てられた複合体のDNAフットプリントを見るには、組み立てプロセスの後半に追加されるタンパク質に対する抗体を選択することを勧めている。 「

Zeroing in on factor binding

Steger が使用するもうひとつの手法は ChIP-exo (ChIP exonuclease) である。 彼はこれを用いて、さまざまな因子がゲノムのどこに結合しているかを塩基対の分解能で特定するのです。

この技術は、超音波処理によるDNAの断片化から始まります。 エキソヌクレアーゼがDNAを（5′-3’方向に）噛み砕き、DNAがホルムアルデヒドによって結合しているタンパク質の端に到達させるのである。 この手法により、結合した因子のDNAの「足跡」が鮮明になり、ChIP-seqを用いて計算で生成される推定モチーフよりも正確な結果が得られる可能性がある。

ペンシルバニア州ユニバーシティパークにあるペンシルバニア州立大学生化学・分子生物学教授のFrank Pughのチームは、最近ChIP-exo法を単純化して、よく使われるイルミナ配列決定プラットフォームに適応させたのです。 同様に、ミズーリ州カンザスシティにあるStowers Institute for Medical Researchの准研究員Julia Zeitlingerとその同僚は、関連技術であるChIP-nexusを発表している。 両方の開発について、カリフォルニア州スタンフォード大学の遺伝学部長兼Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine所長であるMichael Snyder氏は、「有望である」と述べています。

フリードマンが開発したものを含め、一部の技術では、バーコード付きの配列決定アダプターを使用することにより、サンプル サイズを小さくすることができます。 また、「ChIPmentation」と呼ばれる新しい技術では、シーケンシングライブラリーの作成に関わるステップを減らすことができます。

新しい研究室に導入されつつある方法の1つが、ワシントン州シアトルのフレッド・ハッチンソンがん研究センターのスティーブ・ヘニコフと彼の同僚が開発したCUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease)です。 この方法は、ホルムアルデヒドによる架橋や超音波処理によるDNAのせん断を必要としない。 その代わりに、標的に対する抗体を微小球ヌクレアーゼ（MNase）につなぎ、カルシウムで活性化させて標的の両側のDNAを切断するのである。 得られたDNA断片は配列決定される。

CUT&RUN には、細胞数の少なさ以外の利点もあります。 分子生物学者でハーバード大学の教授である Stuart Orkin 氏は、「本質的にヌクレオチド レベル」の分解能を持つこの技術を高く評価しています。 彼のグループは、計算ツールに少し手を加えるだけで、胎児ヘモグロビンの発現制御に関与する転写因子の、間隔の狭い結合部位を区別することに成功したのだ。 この結果を得る以前は、ホルムアルデヒド架橋によりエピトープが隠されていたためか、従来のChIPでは転写因子を免疫沈降させることができなかった。

Henikoff の研究室では、長距離の 3D DNA 相互作用を評価するためにこの技術を応用し、切断された断片に対して、2 番目の抗体を使用して免疫沈降を行いました。 同グループは、同じタンパク質複合体上の2つの分子的特徴を調査した。このアプローチは、ヒストンマーカーのどの組み合わせがさまざまな遺伝子状態に関連しているかといった問題の解決に役立つと考えられる。

単一細胞レベルでの研究

クロマチン研究者を含む多くの分子生物学者にとって、単一細胞は最後のフロンティアである。

「単一細胞で単一分子の相互作用を系統的に直接評価する、正確で決定論的な方法を考え出す必要があります」と、バーンスタイン氏は言います。 “それは長期的な目標です。” 単一細胞データは、発生中の細胞が幹細胞状態から抜けるとき、あるいは細胞の不均一性が高い腫瘍において、DNA結合因子を追跡できる可能性があります。

いくつかのアプローチは、この目標に近づいています。 しかし、「多くの単一細胞法は、感度が限られています」と、カリフォルニア大学サンディエゴ校のゲノム生物学者であるChristopher Benner氏は言う。 例えば、Bernsteinたちは、マイクロ流体システムとバーコーディングを使って、単一細胞のChIPseqデータを作成した。 この技術では、各細胞から、DNA結合事象を表す500〜10,000個のユニークな「リード」が取得され、細胞集団で取得される数百万個のリードとは対照的であることがわかった。

いくつかの方法は、ゲノムの活性領域に関するデータも得ることができます。 ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）は、オープンクロマチン領域でゲノムに統合する高活性トランスポザーゼを配置し、シーケンシングアダプターを導入するものである。 ATAC-seqは単一細胞に適用することができ、得られた配列データは様々な計算機的アプローチで解析することができます。 これらのアプローチにより、例えば、プロモーター配列の同定や、DNA制御要素をノックアウトしたりRNA発現を評価したりする実験におけるパターンの同定を行うことができる。

ATAC-seqには、アクセス可能な領域への統合が不完全であるなどの欠点があると、スナイダー氏は指摘します。 しかし、この技術は強力であり、蛍光色素を挿入して画像化するために展開することができ、結果として、配列決定前に3Dゲノム組織に関する画像データを得ることができると、Snyder氏は指摘する。

Snyder氏は、スタンフォード大学のAlistair Boettiger氏のような研究室におけるイメージング研究を指摘しています。彼は、超解像イメージングを用いて遺伝要素および新生RNA転写物を同時にイメージングする方法を開発し、どの要素が遺伝子発現を促進または抑制しているかを評価しようとしています。 Stamatoyannopoulosは、「画像化は未来です」と付け加えた。 他の研究者は、「第3世代」ナノポアシーケンスが進歩すれば、それに接続するChIP的手法が開発されるだろうと述べている。

「これを行うには、まったく直交する方法が必要かもしれません」と、単細胞クロマチン解析について語るのは、Bern-Stein氏である。 その目標は、最終的には、「今使っているものとは根本的に異なる技術」によって、うまく達成される可能性が高いと、彼は言っています。

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