Caco-2 Permeability Assay

Caco-2 Permeabilityに関するQ&A

CyprotexのCaco-2 Permeability assayについて教えてください。

Caco-2 細胞はヒトの薬剤吸収を予測する体外モデルとして広く使用されています。 Caco-2細胞株は、ヒト大腸癌に由来し、培養すると、細胞は自然に極性腸細胞の単層に分化します。

この細胞をマルチウェルインサートプレートに播き、実験前に20日間かけてコンフルエントの単層を形成させます。 20日目に試験化合物を膜の頂膜側に添加し、単層を横切る化合物のフラックスを2時間にわたってモニターする。 薬物の流出を調査するためには、基底側コンパートメントからアピカルコンパートメントへの化合物の輸送を調査することも必要である。

透過係数（Papp）は、以下の式から計算される：

ここで、dQ/dtは細胞を横切る薬物の透過速度、C0は時間ゼロにおけるドナー濃度、Aは細胞単層の領域である。

Caco-2透過性アッセイからのデータをどのように解釈すればよいですか？

Caco-2透過性アッセイからのデータを使用するには、いくつかの方法があります。 まず、化合物をそのPapp値でランク付けすることができます。 2つの参照化合物、アテノロール（受動的傍細胞輸送）とプロプラノロール（受動的経細胞輸送）は、試験化合物と一緒にスクリーニングされる。 アテノロールとプロプラノロールのヒトでの吸収率はそれぞれ50%と90%であることが知られており2,3、テスト化合物をランク付けするためのマーカーとして使用することが可能です。 次に、他のin vitroパラメータと合わせて、シミュレーションソフトウェアCloe PKを使用して、in vivoでの化合物の経口薬物動態を予測することができます。 図3
Caco-2由来のPactive（（PappB-A – PappA-B）/2）とin situ BBB透過率、logPS（透過率-表面積積）の相関関係。 BBBを透過することが知られている薬物（カフェイン、イミプラミン、プロゲステロン）はlogPS >-2.0 （緑の網掛け部分）、BBBを透過しないことが知られている薬物（アルドステロン、ヒドロコルチゾン、シメチジン）はlogPS ≤-3.5 （ピンクの網掛け部分）であることが示されている。

Caco-2細胞で有意なレベルの流出活性を受けない化合物、すなわち、PactiveとlogPSの間の明確な相関を示す回帰直線を示す。 Pactiveが< 5 × 10 -6 cm/sである化合物について。 この相関を利用して、CyprotexのCaco-2アッセイは、Pactive < 5 × 10 -6 cm/sの化合物のBBBの可能性を評価することができます。

Caco-2透過性とヒト腸管吸収の関係は？

Caco-2透過性（アピカルおよびベースサイドコンパートメントの両方にpH7のHBSSバッファを使用して）およびヒト腸管吸収との関係が図4に表示されています。 この相関関係は、これら2つのパラメータについて文献で観察されたものと典型的なものである4。 このプロットは、腸管吸収のデータの精度に影響されることに注意することが重要である。 このプロットで使用されている腸管吸収の値は、Zhaoら, 20012から引用されている。 この論文では、ヒトの腸管吸収は様々なソースから抽出されたものであり、その質はかなり異なっている。 また、いくつかの化合物は用量依存的な吸収を示すことが知られている（グラフのエラーバーで示す）

PAMPAとCaco-2透過性アッセイの違いは何ですか？

Caco-2透過性スクリーンはPAMPA（パラレル人工膜透過性アッセイ）よりも生体内でのヒトの吸収を代表すると考えられています。 PAMPAは受動拡散の指標となるだけですが、Caco-2モデルは能動的な取り込みや排出を示す化合物、あるいは傍細胞経路で膜を通過する化合物のヒトでの吸収をよりよく予測することが可能です。

薬物の排出をどのように測定するのですか？

双方向Caco-2透過性アッセイは、化合物の輸送を頂膜から底膜、および底膜から頂膜の方向で測定するものです。 結果は通常、Papp(B-A)/Papp(A-B)のような流出率で報告される。 流出比が2より大きい場合、薬物の流出が起こっていることを意味する。 P-gpの基質として知られているタリノロールを対照化合物としてスクリーニングし、細胞が機能的な排出トランスポータータンパク質を発現していることを確認します。 また、実験開始時に膜の完全性マーカーであるルシファーイエローを被験物質と一緒にインキュベートする。 1 つのウェルでルシファーイエローの Papp が 1.0 × 10 -6 cm/s を超えても、そのウェルにおける被験物質または対照物質の Papp の結果が、残りの複製ウェルで得られた結果と定性的に同じであれば（ルシファーイエローの閾値以内）、担当科学者の科学的判断に基づき、細胞単層は許容範囲とみなすことができる。 そうでない場合、影響を受けた単層からの結果は除外され、n=1 の結果が報告されるか、または化合物の再試験が行われるかもしれない。 もし両方の複製が影響を受けた場合、その化合物は再スクリーンされる。

回収率の算出方法とその理由

回収率は、Caco-2データを解釈する上で有用です。 回収率が非常に低い場合、溶解度の低さ、プレートへの化合物の結合、Caco-2細胞による代謝、細胞単層での化合物の蓄積などの問題があることが考えられます。